雪茄煙中霉菌培養(yǎng)基種類篩選、計(jì)數(shù)方法適用性研究（二）
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1樣品稀釋
每個(gè)樣品各稱取25 g，用無(wú)菌剪刀剪碎，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，均質(zhì)器3擋均質(zhì)3 min，取均質(zhì)后樣液梯度稀釋，按照前期對(duì)樣品中霉菌含量的評(píng)估，依次制備4個(gè)稀釋梯度（10?1,10?2,10?3,10??）。每個(gè)樣品3次重復(fù)，進(jìn)行稀釋接種。
1.3.2接種和培養(yǎng)
分別使用平板傾注法和平板涂布法在3種培養(yǎng)基上進(jìn)行平行試驗(yàn)，最后對(duì)3種培養(yǎng)基及兩種接種方式進(jìn)行比較。
平板傾注法（QZ）：先吸取1 mL各樣品的梯度稀釋液于培養(yǎng)皿中，再將20~25 mL 45℃左右的高壓蒸汽滅菌后的培養(yǎng)基傾倒于培養(yǎng)皿中。然后沿同一時(shí)針?lè)较蜉p微旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使樣品與培養(yǎng)基混合均勻，待培養(yǎng)基完全凝固后用封口膜密封，標(biāo)記后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)于28℃±1℃正置培養(yǎng)。其中GB法與YC/T法需培養(yǎng)至第5天，Biokar法需培養(yǎng)至第3天。
平板涂布法（TB）：吸取各樣品的梯度稀釋液于各培養(yǎng)基表面（每個(gè)稀釋度分別吸取0.333 mL接種量并分別加入到3塊已提前制備好的培養(yǎng)基平板中），后用一次性無(wú)菌L型涂布棒涂抹均勻，待培養(yǎng)基表面水分晾干后密封進(jìn)行正置培養(yǎng)，培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法與平板傾注法相同。具體技術(shù)路線及方法簡(jiǎn)稱如圖1所示。
圖1技術(shù)路線
1.3.3霉菌判讀,計(jì)數(shù)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
按照各培養(yǎng)基特點(diǎn)直接肉眼觀察（必要時(shí)使用放大鏡）判別霉菌形態(tài)。
平板傾注法（最低檢出限10 CFU/g）霉菌計(jì)數(shù)公式：
霉菌含量=(∑???Q?/3)×T(1)
式中：Q?為每個(gè)重復(fù)的霉菌菌落總數(shù)；i為重復(fù)次數(shù)；T為稀釋倍數(shù)。
平板涂布法（最低檢出限10 CFU/g）霉菌計(jì)數(shù)公式：
霉菌含量=(∑???T?/3)×T(2)
式中：T?為每個(gè)重復(fù)的霉菌菌落總數(shù)；i為重復(fù)次數(shù)；T為稀釋倍數(shù)。
按照GB 4789.15—2016進(jìn)行霉菌菌落計(jì)數(shù)。
1.4數(shù)據(jù)分析
使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，將所檢測(cè)霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化為以10為底數(shù)的對(duì)數(shù)值（未檢出樣品的對(duì)數(shù)值按0.7統(tǒng)計(jì)），采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)各方法對(duì)霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的差異顯著性。
使用Med Calc®Version 19.0.4軟件繪制Bland-Altman圖，其基本原理是計(jì)算出兩方法測(cè)量結(jié)果的一致性界限，并以圖形方式直觀反映，同時(shí)根據(jù)實(shí)際測(cè)量結(jié)果判斷兩種方法是否具有一致性。
2結(jié)果與討論
2.1霉菌計(jì)數(shù)方法比較
2.1.1 3種培養(yǎng)基平板涂布法的比較
對(duì)3種培養(yǎng)基平板涂布法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果分別進(jìn)行Bland-Altman圖比較，如圖2,圖3和圖4所示。將GB法-TB,Biokar法-TB和YC/T法-TB進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除低濃度樣本中的個(gè)別數(shù)據(jù)分布在95%上下限之外，其余樣本占比分別為92.31%,92.31%和89.74%的數(shù)據(jù)點(diǎn)落在95%上下限內(nèi)，說(shuō)明3種方法間檢測(cè)結(jié)果一致性較好。當(dāng)樣品中霉菌含量低于102CFU/g時(shí)，培養(yǎng)基對(duì)霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響較大，而當(dāng)樣品中霉菌含量高于102CFU/g時(shí)，培養(yǎng)基對(duì)霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性較好。表明3種培養(yǎng)基采用平板涂布法進(jìn)行接種，對(duì)霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響與樣品中霉菌含量有關(guān)。
如圖5所示，通過(guò)對(duì)A,B,C,D,E等5個(gè)樣品的菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，3種培養(yǎng)基采用平板涂布法接種培養(yǎng)后樣品中典型霉菌菌落形態(tài)區(qū)別較大，其中GB法與YC/T法霉菌菌落較大，形態(tài)清晰易判讀。Biokar法典型菌落較小，分布均勻，更有助于計(jì)數(shù)，但較難從菌落形態(tài)上區(qū)分出不同種類的霉菌，由此推測(cè)Biokar法所用SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基中生長(zhǎng)促進(jìn)劑和選擇性系統(tǒng)既可以促進(jìn)霉菌的快速生長(zhǎng)又能抑制霉菌菌絲的過(guò)度繁殖。綜合比較發(fā)現(xiàn)，平板涂布法接種培養(yǎng)基上霉菌菌落全部生長(zhǎng)于培養(yǎng)基表面，GB法與YC/T法的典型霉菌菌落形態(tài)最易判別，而B(niǎo)iokar法更易快速計(jì)數(shù)。
2.1.2 3種培養(yǎng)基的平板傾注法比較
對(duì)3種培養(yǎng)基的平板傾注法進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6,圖7和圖8所示。從Bland-Altman圖中發(fā)現(xiàn)，94.87%的數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%上下限內(nèi)，表明3種培養(yǎng)基的平板傾注法結(jié)果一致性較好。檢測(cè)樣品中霉菌含量低于102CFU/g時(shí)，3種培養(yǎng)基在平板傾注法接種條件下與平板涂布法接種條件下表現(xiàn)出的霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果一致。說(shuō)明無(wú)論采用平板傾注法還是平板涂布法接種，當(dāng)樣品中霉菌含量低于102CFU/g時(shí)，各培養(yǎng)基所對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)方法均存在一定的波動(dòng)性。
3種培養(yǎng)基中平板傾注法對(duì)樣品中霉菌生長(zhǎng)狀況的影響如圖9所示。平板傾注法與平板涂布法相比，霉菌菌落除生長(zhǎng)于培養(yǎng)基表面外，還在培養(yǎng)基內(nèi)部呈現(xiàn)出不同的立體生長(zhǎng)形態(tài)。YC/T法和GB法菌落生長(zhǎng)形態(tài)相似，部分霉菌生長(zhǎng)速率過(guò)快，菌落易蔓延，相互交錯(cuò)，影響計(jì)數(shù)。Biokar法霉菌生長(zhǎng)速率較慢，更利于霉菌計(jì)數(shù)。
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