快速藥敏檢測技術(shù)方法、原理、臨床轉(zhuǎn)化需求（一）
1.3顯微自動聚焦技術(shù)與丹麥Biosense oCelloScope系統(tǒng)的技術(shù)融合
在傳統(tǒng)稀釋法藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，顯微自動聚焦技術(shù)通過高頻顯微拍攝（每小時(shí)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測），實(shí)時(shí)捕捉微生物在數(shù)量與形態(tài)上的變化，結(jié)合算法分析與數(shù)據(jù)庫比對，2～8小時(shí)內(nèi)即可報(bào)告藥物的MIC值。目前，該技術(shù)已在陰性桿菌、葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌等多種臨床常見細(xì)菌的藥敏檢測中表現(xiàn)出良好性能，相關(guān)驗(yàn)證數(shù)據(jù)正在進(jìn)一步完善中。
丹麥Biosense公司的微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)oCelloScope，正是基于“顯微自動聚焦+動態(tài)成像分析”的技術(shù)原理，實(shí)現(xiàn)了藥敏檢測的快速化與精準(zhǔn)化，且在技術(shù)細(xì)節(jié)上進(jìn)行了多項(xiàng)創(chuàng)新優(yōu)化。該系統(tǒng)集成高分辨率光學(xué)成像模塊、恒溫孵育模塊與智能圖像分析系統(tǒng)，可在藥敏孵育過程中對微生物進(jìn)行連續(xù)動態(tài)拍攝——每小時(shí)自動完成多次聚焦與成像，通過識別微生物形態(tài)（如細(xì)胞長度、寬度、團(tuán)聚狀態(tài)）與數(shù)量的細(xì)微變化，早期判斷細(xì)菌是否被抗菌藥物抑制。
相較于傳統(tǒng)顯微自動聚焦技術(shù)，oCelloScope系統(tǒng)在以下方面實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵技術(shù)突破：
超高靈敏度成像能力：采用定制化光學(xué)鏡頭與高穩(wěn)定性光源，可清晰捕捉單個細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)變化——即使在孵育2小時(shí)內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量未出現(xiàn)顯著增長時(shí)，也能通過細(xì)胞腫脹、分裂停滯、細(xì)胞膜完整性改變等細(xì)微形態(tài)特征，早期識別抗菌藥物的抑制作用，進(jìn)一步縮短檢測時(shí)間；
全流程自動化與智能化：系統(tǒng)覆蓋從樣本加樣、恒溫孵育、動態(tài)成像到結(jié)果分析的全流程自動化操作，無需人工干預(yù)，有效減少人為操作誤差；內(nèi)置的微生物形態(tài)數(shù)據(jù)庫涵蓋臨床常見致病菌（如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等），可通過AI算法自動比對不同藥物濃度下的微生物生長曲線，快速計(jì)算并輸出MIC值，降低對操作人員專業(yè)水平的要求；
廣譜臨床適用性：通過大量臨床驗(yàn)證，該系統(tǒng)可適用于革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌等多種臨床常見細(xì)菌的藥敏檢測，無需依賴專屬藥敏折點(diǎn)，可適配β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等臨床常用抗菌藥物，有效解決了RAST方法適用范圍有限的問題；
臨床標(biāo)本直接檢測能力：該系統(tǒng)支持對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本、尿液標(biāo)本等臨床樣本的直接藥敏檢測，無需經(jīng)過傳統(tǒng)的純培養(yǎng)步驟——例如，對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的藥敏檢測可在4～6小時(shí)內(nèi)完成，較傳統(tǒng)方法（24～48小時(shí)）縮短20小時(shí)以上，為重癥感染患者的緊急救治提供關(guān)鍵支持。
目前，oCelloScope系統(tǒng)已在多項(xiàng)臨床研究中驗(yàn)證了其性能：針對肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等常見耐藥菌的藥敏檢測，其結(jié)果與微量肉湯稀釋法的基本一致性（EA）達(dá)到95%以上，分類一致性（CA）維持在85%～90%，且對碳青霉烯類耐藥菌（CRE）的檢測準(zhǔn)確率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法[參考Biosense臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)]。
二、基于熒光標(biāo)記顯示細(xì)胞活性的快速藥敏技術(shù)
此類技術(shù)的核心原理是通過熒光物質(zhì)標(biāo)記微生物細(xì)胞的特定成分，利用熒光信號的變化反映細(xì)胞活性狀態(tài)，進(jìn)而判斷抗菌藥物的抑制效果。其顯著優(yōu)勢在于，可在微生物未形成肉眼可見生長前，通過熒光信號放大微生物活性的早期差異，實(shí)現(xiàn)藥敏結(jié)果的快速判讀。
2.1三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法
ATP是所有活細(xì)胞的核心能量載體，微生物細(xì)胞內(nèi)的ATP含量相對穩(wěn)定；熒光素酶可催化熒光素發(fā)生氧化反應(yīng)并釋放生物光，而該反應(yīng)的啟動必須以ATP為底物——當(dāng)熒光素濃度足量時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與體系內(nèi)游離ATP的含量呈正相關(guān)[13]?；谶@一特性，ATP生物發(fā)光法可通過檢測熒光強(qiáng)度間接反映微生物活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥敏檢測。
國外學(xué)者最早將該技術(shù)應(yīng)用于快速藥敏檢測，2小時(shí)內(nèi)即可獲得MIC值，檢測限可達(dá)103CFU/mL，但該方法需先對微生物進(jìn)行裂解以提取ATP，操作步驟較為復(fù)雜[14]。國內(nèi)向杰等學(xué)者對該技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，省去ATP提取步驟，根據(jù)抗菌藥物作用機(jī)制的差異（將藥物分為生長依賴型/抑菌劑、致死依賴型/殺菌劑），設(shè)計(jì)不同的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)化后的方法與微量肉湯稀釋法的檢測結(jié)果對比顯示，基本一致性（EA）達(dá)到90%，分類一致性（CA）為80%～84%，檢測周期從傳統(tǒng)的16～24小時(shí)縮短至5～6小時(shí)[15]。
此外，劉君等學(xué)者將該技術(shù)拓展至結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測領(lǐng)域，通過優(yōu)化孵育條件與檢測參數(shù)，可在（6.6±2.1）天內(nèi)獲得藥敏結(jié)果，與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的符合率達(dá)到95.2%，顯著縮短了結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測的周期，為結(jié)核病的精準(zhǔn)治療提供了支持[16]。
2.2熒光細(xì)胞染色法
該技術(shù)利用熒光染料的細(xì)胞膜滲透性差異，區(qū)分細(xì)菌的活性狀態(tài)：熒光染料SYBR GreenⅠ可穿透完整的細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，使活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光；碘化丙啶則無法穿透完整細(xì)胞膜，僅能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的死亡細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞，使這類細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。通過熒光顯微鏡或熒光分析儀檢測體系內(nèi)綠/紅熒光的比值，即可量化細(xì)菌種群的存活狀態(tài)，進(jìn)而判斷抗菌藥物的抑制效果。
Zhang等學(xué)者與Feng等學(xué)者分別基于該原理開發(fā)快速藥敏檢測方法，均實(shí)現(xiàn)了30～60分鐘內(nèi)獲得快生長病原微生物藥敏結(jié)果的突破[1718]，為臨床緊急感染救治提供了高效解決方案。
除上述雙色熒光染色法外，刃天青染色法也是常用技術(shù)路徑。刃天青作為一種氧化還原指示劑，在氧化狀態(tài)下呈藍(lán)色，在還原狀態(tài)下會不可逆地轉(zhuǎn)化為粉紅色熒光產(chǎn)物試鹵靈。細(xì)菌在生長繁殖過程中，細(xì)胞內(nèi)處于還原環(huán)境，攝入細(xì)胞內(nèi)的刃天青會被還原為試鹵靈并釋放至培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，且熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)?；谶@一特性，該方法最快可在2小時(shí)內(nèi)獲得細(xì)菌藥敏結(jié)果[19]。但該技術(shù)存在一定局限性：刃天青無法被銅綠假單胞菌等非發(fā)酵革蘭陰性桿菌代謝，因此不適用于這類細(xì)菌的藥敏檢測，臨床應(yīng)用范圍受限。為拓展應(yīng)用場景，研究者開發(fā)基于刃天青還原法的微流體芯片技術(shù)，用于尿液中分離細(xì)菌的藥敏檢測，6小時(shí)內(nèi)可獲得MIC值[20]。
2.3 qPCR檢測細(xì)菌16S rDNA
微生物與抗菌藥物共同孵育過程中，細(xì)胞代謝變化具有時(shí)間差異性：RNA與DNA的變化會在2小時(shí)內(nèi)顯現(xiàn)，而蛋白質(zhì)的變化則需4小時(shí)后才出現(xiàn)?？紤]到RNA在體外易降解，難以保證檢測穩(wěn)定性，使用通用引物檢測細(xì)菌16S rDNA（細(xì)菌核糖體RNA的編碼基因，具有物種特異性與高度保守性）更具臨床應(yīng)用前景。
中國科學(xué)院武漢病毒研究所羅俊博士團(tuán)隊(duì)基于這一思路，利用qPCR技術(shù)檢測與抗菌藥物共同孵育后的細(xì)菌16S rDNA，通過分析核酸拷貝數(shù)的變化判斷細(xì)菌生長抑制情況。在對36株銅綠假單胞菌和28株金黃色葡萄球菌的藥敏檢測中，該方法與標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法的結(jié)果一致性分別達(dá)到97.22%和96.43%[21]，驗(yàn)證了技術(shù)準(zhǔn)確性。Xie等學(xué)者也通過類似技術(shù)路徑，在孵育2小時(shí)后成功檢測出鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌對不同抗菌藥物的敏感性[22]，進(jìn)一步證明了該技術(shù)的可行性。
三、基于細(xì)胞代謝狀態(tài)/產(chǎn)物檢測的快速藥敏技術(shù)
此類技術(shù)的核心邏輯是通過捕捉微生物代謝過程中的產(chǎn)物變化（如揮發(fā)性有機(jī)化合物、生物大分子合成情況），間接反映微生物的活性狀態(tài)，進(jìn)而判斷抗菌藥物的抑制效果。其關(guān)鍵優(yōu)勢在于利用高靈敏度檢測技術(shù)，放大代謝信號的早期差異，實(shí)現(xiàn)藥敏結(jié)果的快速判讀。
3.1代謝產(chǎn)物顯色法
細(xì)菌在生長繁殖過程中會釋放多種揮發(fā)性有機(jī)化合物，包括胺類、醛類、芳香族化合物、酮類、酯類等?；谶@一特性，研究者設(shè)計(jì)了帶有化學(xué)小分子感受器的藥敏檢測孔——這些感受器可與細(xì)菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物發(fā)生特異性反應(yīng)，導(dǎo)致顏色變化。檢測儀器每10分鐘對感受器顏色進(jìn)行一次掃描，通過對比不同藥物濃度下感受器的顏色變化，可在早期區(qū)分有細(xì)菌生長與無細(xì)菌生長的藥敏孔，進(jìn)而計(jì)算得出藥物的MIC值。
Antonelli等學(xué)者基于該技術(shù)搭建檢測平臺，直接對革蘭陰性桿菌血培養(yǎng)肉湯進(jìn)行藥敏檢測，平均獲得藥敏結(jié)果的時(shí)間僅為4.6小時(shí)，較傳統(tǒng)方法縮短24～48小時(shí)[23]。該平臺還具有兩大優(yōu)勢：一是血培養(yǎng)顯示陽性后16小時(shí)內(nèi)的肉湯標(biāo)本均可使用，無需嚴(yán)格控制標(biāo)本采集時(shí)間；二是可檢測16～22種抗菌藥物，包括頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢洛扎/他唑巴坦、美羅培南/韋博巴坦等新型抗菌藥物，為多重耐藥菌感染的精準(zhǔn)治療提供了關(guān)鍵支持。
3.2拉曼光譜技術(shù)
拉曼散射是一種特殊的光散射現(xiàn)象：當(dāng)光穿過介質(zhì)時(shí)，極少數(shù)光子會與介質(zhì)分子發(fā)生能量交換，導(dǎo)致散射光的頻率發(fā)生改變。通過光譜儀對散射光進(jìn)行色散處理，并由探測器采集信號，可獲得拉曼光譜。分析拉曼光譜中峰的位置、漂移、寬度、強(qiáng)度等信息，可實(shí)現(xiàn)對樣品的定性與定量分析。目前，拉曼光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、安檢安防、考古探測等多個領(lǐng)域。
在藥敏檢測領(lǐng)域，病原菌細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子均可通過拉曼光譜呈現(xiàn)特征峰，且峰強(qiáng)度與分子在細(xì)胞內(nèi)的含量呈正相關(guān)。當(dāng)微生物受到抗菌藥物作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)生物大分子的組成與代謝產(chǎn)物會發(fā)生改變，這些變化可通過拉曼光譜被精準(zhǔn)捕捉，進(jìn)而判斷抗菌藥物的效果——由于這類方法無需添加外源標(biāo)記物，僅依賴微生物自身的光譜信號，因此被歸為拉曼藥敏技術(shù)的非標(biāo)記檢測法[24]。
除非標(biāo)記法外，標(biāo)記法拉曼光譜技術(shù)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，其中以重水（D?O）標(biāo)記法最為成熟。該方法將D?O摻入藥敏培養(yǎng)基中，使其作為代謝標(biāo)記物參與細(xì)菌的生物合成過程：重水中的氘原子會整合到細(xì)菌合成的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子中，在拉曼光譜的“生物靜默區(qū)”（該區(qū)域無其他生物分子的光譜信號干擾）形成明顯的CD特征峰，且峰強(qiáng)度與細(xì)菌的代謝活性呈正相關(guān)[25]。
該技術(shù)的通用檢測步驟為：首先將細(xì)菌在含不同濃度抗菌藥物的培養(yǎng)基中孵育1～2小時(shí)；隨后向培養(yǎng)基中加入濃度為30%～100%的D?O，繼續(xù)孵育30分鐘左右；最后通過拉曼光譜儀檢測CD峰強(qiáng)度，根據(jù)峰強(qiáng)度判斷細(xì)菌的代謝活性，進(jìn)而篩選出有效抗菌藥物[26]。
該技術(shù)具有三大核心優(yōu)勢：一是無需對微生物進(jìn)行培養(yǎng)、染色或其他標(biāo)記處理，可直接檢測臨床標(biāo)本；二是檢測速度快，對尿液標(biāo)本的藥敏檢測僅需2.5小時(shí)，遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)方法（48小時(shí)）；三是適用于無法培養(yǎng)或難培養(yǎng)的微生物（如某些厭氧菌、苛養(yǎng)菌）的藥敏檢測，為特殊感染性疾病的治療提供了新的技術(shù)路徑[27]。
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