?微生物生長(zhǎng)減緩或暫停狀態(tài)的分類(lèi)
我們熟知的微生物生長(zhǎng)減緩或暫停狀態(tài)包括靜止、休眠、饑餓誘導(dǎo)的靜止期，以及如抗生素中的持久性狀態(tài)。在理解這些以及其他類(lèi)似狀態(tài)時(shí)，我們面臨一些挑戰(zhàn)。一個(gè)主要的難點(diǎn)是確定一個(gè)群體中是否真的沒(méi)有細(xì)胞在分裂，因?yàn)橥ǔ２粫?huì)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行足夠長(zhǎng)時(shí)間的監(jiān)測(cè)。在許多情況下，要確定需要監(jiān)測(cè)多長(zhǎng)時(shí)間才能觀(guān)察到細(xì)胞的變化還是一個(gè)未解之謎。例如，在1°C的條件下，可能需要長(zhǎng)達(dá)兩周時(shí)間的顯微鏡攝像才能觀(guān)察到酵母細(xì)胞的大小變化。
另一個(gè)挑戰(zhàn)是，即使在由相同細(xì)胞組成的群體中，也可能存在多種不同的生長(zhǎng)減緩或暫停狀態(tài)，這些狀態(tài)只有在單細(xì)胞層面上才能被檢測(cè)出來(lái)。比如，在饑餓狀態(tài)下的酵母細(xì)胞同源群體中，一些細(xì)胞可能處于靜止?fàn)顟B(tài)，而其他細(xì)胞可能正在形成孢子。通過(guò)單細(xì)胞層面的測(cè)量，最近的研究發(fā)現(xiàn)，即使在同源群體中，也存在著一個(gè)連續(xù)的非生長(zhǎng)狀態(tài)梯度。這意味著每個(gè)細(xì)胞都展現(xiàn)出獨(dú)特的可量化表型。一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是，不同微生物狀態(tài)之間的相關(guān)性有多大，因?yàn)榭雌饋?lái)不同的兩種狀態(tài)實(shí)際上可能是相同的。特別是在休眠方面，作為真核生物休眠孢子，即使在沒(méi)有任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下，也能表達(dá)基因。
同樣，通過(guò)測(cè)量遇到抗生素的單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞的再生長(zhǎng)能力，研究人員最近提出了“休眠深度”這一概念，將死亡與活躍但不生長(zhǎng)的狀態(tài)聯(lián)系起來(lái)。在這種情況下，休眠深度越深，細(xì)胞在抗生素消失后恢復(fù)和重新生長(zhǎng)所需的時(shí)間就越長(zhǎng)；休眠深度太深可能意味著細(xì)胞永遠(yuǎn)無(wú)法恢復(fù)（即死亡）。
休眠中的生命動(dòng)態(tài)
普遍的觀(guān)點(diǎn)是休眠孢子中不存在任何細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。這種看法主要基于兩個(gè)因素：一是孢子缺乏外部能量來(lái)源，如營(yíng)養(yǎng)；二是某些孢子的細(xì)胞質(zhì)呈玻璃狀，這限制了蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)和化學(xué)反應(yīng)。支持這種觀(guān)點(diǎn)的一個(gè)論據(jù)是，與分裂的微生物細(xì)胞相比，處于靜止期或休眠期的微生物的基因表達(dá)水平大幅降低。雖然長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為休眠狀態(tài)是一種完全不活躍的狀態(tài)，但目前并沒(méi)有確切的證據(jù)來(lái)證明休眠孢子完全停止了基因表達(dá)或其他所有細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。這主要是因?yàn)樾菝哝咦觾?nèi)部發(fā)生的生化反應(yīng)非常罕見(jiàn)且緩慢，難以被精確測(cè)量。但這里有一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：為什么我們要區(qū)分極其罕見(jiàn)的事件和根本不存在的事件？事實(shí)上，不常發(fā)生并不意味著無(wú)關(guān)緊要。在休眠孢子中可能發(fā)生著極為罕見(jiàn)的過(guò)程，這些過(guò)程雖然緩慢，但在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)可能會(huì)消耗掉孢子所儲(chǔ)存的、用于萌發(fā)的資源，如核苷酸和ATP。因此，當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，這些罕見(jiàn)的過(guò)程可能會(huì)阻止孢子在未來(lái)發(fā)芽。
最近的研究揭示了決定休眠孢子壽命、發(fā)芽概率和發(fā)芽時(shí)間的多種因素。如前文所述，一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是休眠酵母孢子（S.cerevisiae）的基因表達(dá)能力與孢子的壽命（在休眠期間保持活力）和發(fā)芽?jī)A向有關(guān)。相對(duì)地，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，休眠的枯草芽孢桿菌孢子，由于其細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)了鉀離子（K+）和二苦味酸，無(wú)法進(jìn)行基因表達(dá)、代謝或儲(chǔ)存ATP，這阻止了細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)。因此，由于缺乏ATP，枯草芽孢桿菌孢子不能主動(dòng)感知環(huán)境來(lái)檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的出現(xiàn)。
然而，這些孢子可以通過(guò)受體被動(dòng)地與L-丙氨酸（一種發(fā)芽所需的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）結(jié)合來(lái)引發(fā)發(fā)芽過(guò)程。這個(gè)過(guò)程包括單價(jià)離子和二苦味酸從受體中排出，水分進(jìn)入受體，從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)、代謝活動(dòng)，并最終促使孢子發(fā)芽。這個(gè)被動(dòng)過(guò)程被形象地描述為：細(xì)胞外的L-丙氨酸與其受體結(jié)合，無(wú)需使用ATP，就可以從孢子中“擠出”鉀離子，就像從氣球中擠出空氣一樣，而孢子本身處于被動(dòng)狀態(tài)。在排出足夠多的鉀離子后，枯草芽孢桿菌孢子終于可以開(kāi)始基因表達(dá)并發(fā)芽。
這一發(fā)現(xiàn)對(duì)枯草芽孢桿菌孢子的被動(dòng)特性提出了一些概念性的問(wèn)題，這些問(wèn)題與那些維持ATP消耗過(guò)程的生物（如S.cerevisiae）的休眠孢子不同。通常認(rèn)為，具有活性過(guò)程的休眠孢子的壽命是有限的，因?yàn)檫@些活性過(guò)程會(huì)耗盡其儲(chǔ)存的資源。然而，考慮到其進(jìn)化相關(guān)性，我們期望這些休眠孢子能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持活力。問(wèn)題是，如何使具有活躍過(guò)程的休眠孢子保持較長(zhǎng)壽命？通過(guò)定量方法來(lái)研究并定義這些較少被研究的孢子（例如生活在冰川和海洋沉積物中的孢子）的休眠狀態(tài)，將加深我們對(duì)休眠現(xiàn)象的理解。
解除休眠的動(dòng)力
當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新出現(xiàn)時(shí)，孢子會(huì)開(kāi)始發(fā)芽。但是，引發(fā)孢子萌發(fā)的具體細(xì)胞內(nèi)步驟是什么？為何在同一種群中，有些孢子能夠萌發(fā)而另一些卻不能？最近的研究揭示了發(fā)芽過(guò)程的一些不尋常的特點(diǎn)。一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，對(duì)于枯草芽孢桿菌孢子來(lái)說(shuō)，那些在饑餓狀態(tài)下形成較晚的孢子，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)萌發(fā)的可能性較低。相比之下，較早形成的孢子來(lái)自于在饑餓過(guò)程中分裂次數(shù)較少的細(xì)胞。因此，相比較早形成的孢子，這些較晚形成的孢子擁有較少的萌發(fā)所需因子（如丙氨酸脫氫酶），因?yàn)樗鼈兪怯稍诩?xì)胞分裂過(guò)程中耗盡或稀釋了更多這些因子的細(xì)胞產(chǎn)生的。此外，通過(guò)熒光素酶發(fā)光法補(bǔ)充研究推斷了枯草芽孢桿菌孢子內(nèi)部?jī)?chǔ)存的資源量。這表明，孢子在遇到L-丙氨酸時(shí)會(huì)在不同時(shí)間萌發(fā)，這是因?yàn)殒咦訐碛胁煌瑪?shù)量的輔助萌發(fā)資源，如儲(chǔ)存的氧化還原電位，但不包括ATP。
到目前為止，研究主要集中在休眠孢子的自主萌發(fā)傾向上。一個(gè)有趣的未來(lái)研究方向是探討孢子是否能夠相互幫助萌發(fā)，類(lèi)似于土壤中的Myxococcus xanthus。這種菌株的萌發(fā)孢子能分泌并感知諸如甘氨酸甜菜堿之類(lèi)的“萌發(fā)因子”，從而幫助同一種群中的其他孢子萌發(fā)。這種相互作用的研究可能為我們理解孢子萌發(fā)的過(guò)程提供更多的洞見(jiàn)。
無(wú)孢子微生物
我們已經(jīng)討論了孢子的休眠和萌發(fā)，但那些無(wú)法或不產(chǎn)生孢子的微生物是如何在缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下保持活力的呢？這些微生物，就像休眠孢子一樣，也會(huì)調(diào)整它們的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，可能是為了減少能量消耗。舉例來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)受限的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）表現(xiàn)出緩慢但可檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，這是由于它們的RNA聚合酶活性降低，但并非完全消失。此外，一些生長(zhǎng)受限的細(xì)菌會(huì)緩慢合成蛋白質(zhì)和代謝物，包括ATP。目前的研究重點(diǎn)是確定這些分子和過(guò)程中哪些對(duì)于細(xì)胞群在足夠養(yǎng)分出現(xiàn)時(shí)重新進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段至關(guān)重要。
一個(gè)新興的研究領(lǐng)域是，不同的生長(zhǎng)表型在同源饑餓群體中的共存。這種共存可能為種群提供一種對(duì)沖策略：當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，饑餓種群中的一些細(xì)胞以不同的表型狀態(tài)存在，這樣做可以延長(zhǎng)其生存時(shí)間并更快地恢復(fù)快速生長(zhǎng)。例如，在生長(zhǎng)停滯的同源群體中，只有部分細(xì)胞表現(xiàn)出緩慢生長(zhǎng)；大腸桿菌或枯草桿菌群體中的細(xì)胞在靜止期或休眠期內(nèi)合成蛋白質(zhì)的量不同，取決于細(xì)胞內(nèi)鳥(niǎo)苷酸核苷酸（ppGpp）的濃度；某些饑餓狀態(tài)下的枯草桿菌細(xì)胞不產(chǎn)生孢子，而是形成耐藥性較強(qiáng)的繭狀結(jié)構(gòu)，每隔大約4天分裂一次，能存活數(shù)月。此外，通過(guò)在微流體通道中監(jiān)測(cè)單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝基因表達(dá)，研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間營(yíng)養(yǎng)代謝基因表達(dá)的變異產(chǎn)生了多種對(duì)沖策略。例如，lac操縱子基因表達(dá)的變異可能導(dǎo)致一些大腸桿菌在環(huán)境轉(zhuǎn)換時(shí)進(jìn)入特別長(zhǎng)的滯后期。
研究還表明，饑餓細(xì)胞的存活時(shí)間主要取決于其在饑餓過(guò)程中儲(chǔ)存的分子數(shù)量和類(lèi)型。例如，一種生長(zhǎng)受限的光合細(xì)菌Rhodopseudomonas palustris體內(nèi)儲(chǔ)存的ATP量是其生存時(shí)間的關(guān)鍵因素。由于生命必需的分子并非只有一種，確定哪組分子真正決定了生長(zhǎng)受限、饑餓的細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)能否恢復(fù)生長(zhǎng)變得非常重要。另一個(gè)有前途的研究方向是探索饑餓微生物是如何維持彼此的活力的。例如，大腸桿菌在靜止期通過(guò)“食人新陳代謝”——消耗死亡細(xì)胞釋放的分子——來(lái)生長(zhǎng)和分裂，這使得細(xì)胞群能夠維持活細(xì)胞的時(shí)間比單個(gè)細(xì)胞自主維持的時(shí)間更長(zhǎng)。
極端溫度下的生命動(dòng)態(tài)變化
微生物廣泛分布于地球上各種寒冷的環(huán)境，從海底到冰川不等。它們甚至在城市、公園和沙漠等地，在冬季和夜間也必須忍受?chē)?yán)寒。目前，科學(xué)家正在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)從加拿大北極地區(qū)和永久凍土等極寒環(huán)境中分離出的微生物，這有助于我們開(kāi)始理解許多嗜低溫微生物的生理機(jī)能。研究微生物如何適應(yīng)寒冷環(huán)境的一個(gè)方法是通過(guò)研究在極低溫度下的模式生物。例如，通過(guò)對(duì)酵母菌S.cerevisiae單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的監(jiān)測(cè)并結(jié)合數(shù)學(xué)模型，研究人員最近發(fā)現(xiàn)，在0°C以上和10°C以下的每個(gè)溫度下，酵母菌都有一個(gè)生長(zhǎng)速度的低速和高速極限，這意味著存在最短和最長(zhǎng)的可能倍增時(shí)間。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在這些寒冷溫度下，酵母菌的生存能力和速度極限源自于兩個(gè)相互競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程：活性氧（ROS）的產(chǎn)生和減少。
這項(xiàng)研究指出，酵母減少ROS的速度主要取決于它們合成抗氧化劑所需的時(shí)間，而這又依賴(lài)于基因表達(dá)速度，即轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的平均時(shí)間。值得注意的是，ROS含量并不影響基因表達(dá)速度：無(wú)論ROS含量高低，酵母的基因表達(dá)速度保持一致。令人感興趣的是，最近的研究也證實(shí)，在阻礙大腸桿菌和酵母生長(zhǎng)的高溫條件下，ROS在決定細(xì)胞存活率方面起著至關(guān)重要的作用。例如，在高溫下，大腸桿菌會(huì)停止生長(zhǎng)并觸發(fā)所謂的“熱熔斷”反應(yīng)——MetA（合成蛋氨酸所需的酶）的降解——暫停蛋氨酸和其他分子的合成，而這些分子要么會(huì)產(chǎn)生ROS，要么會(huì)被ROS破壞。有趣的是，即使沒(méi)有任何細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的典型成分（如氨基酸和礦物質(zhì)，但不包括糖）也能產(chǎn)生ROS，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ROS在極端溫度條件下的重要性。
這些發(fā)現(xiàn)表明，細(xì)胞快速減少ROS的能力——在ROS引起的損傷積累到臨界值之前減少ROS——是它們?cè)跇O端溫度下生存的重要甚至可能是主要的決定因素。這些發(fā)現(xiàn)還提示，類(lèi)似于前面提到的枯草芽孢桿菌孢子，氧化還原電位是孢子發(fā)芽能力的一個(gè)重要指標(biāo)。一個(gè)非常有前景的研究方向是量化ROS如何影響全球氣候變暖背景下微生物群落的生態(tài)動(dòng)態(tài)和生存策略。
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