速生集胞藻6803光合放氧速率、生長曲線及基因組分析（一）
【背景】藍(lán)藻是一類能進(jìn)行放氧光合作用的原核生物。隨著生長速率與異養(yǎng)微生物相仿的速生藍(lán)藻的出現(xiàn)，藍(lán)藻在光合細(xì)胞工廠領(lǐng)域備受關(guān)注。集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803是研究光合作用的理想模式生物，也是近年來常用的光合固碳產(chǎn)化學(xué)品底盤細(xì)胞，其基因組測序最早被公開，并且比常用模式藍(lán)藻聚球藻具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性及性狀穩(wěn)定性，但目前尚未見速生集胞藻的報道。
【目的】評價本實驗室選育的在高光強(qiáng)下可以快速生長的集胞藻6803(高光6803)在高光強(qiáng)下的光合生理，并初步研究其分子機(jī)制。
【方法】通過比較分析光合生理，評價高光6803性狀穩(wěn)定性；通過基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析，初步解析高光6803的分子機(jī)制。
【結(jié)果】獲得1株快速生長的集胞藻，即高光6803，其生長速率和光合活性均遠(yuǎn)高于普通集胞藻6803，并且性狀穩(wěn)定；其最短倍增時間約3.1 h，與已報道的速生聚球藻(Synechococcus elongatus)UTEX 2973相當(dāng)；其在900μmol/(m2·s)的高光強(qiáng)下仍可快速生長，并且最適光強(qiáng)是野生型集胞藻6803的3倍以上。基因組學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)高光6803基因組中有2個特有基因突變。轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)，在高光條件下，高光6803中差異表達(dá)的基因有77個，其中上調(diào)基因36個，下調(diào)基因41個。表達(dá)上調(diào)的基因主要參與光系統(tǒng)II(photosystem II,PSII)反應(yīng)中心、高光脅迫耐受、電子傳遞、有機(jī)物合成，而表達(dá)下調(diào)的基因主要參與糖類、氨基酸等有機(jī)物分解過程。
【結(jié)論】本研究首次報道了速生集胞藻高光6803，并對其分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。找到與其高效利用高光快速生長相關(guān)的2個突變靶基因，并從轉(zhuǎn)錄組水平說明高光6803是通過高效利用光能而快速生長。因此，本研究不僅拓寬了速生藍(lán)藻的種類，為研究光合微生物固碳產(chǎn)化學(xué)品提供了高效的底盤細(xì)胞，也為將其他藍(lán)藻改造為速生藍(lán)藻提供了基因靶點及理論基礎(chǔ)。
藍(lán)藻是地球上已知最早可進(jìn)行放氧光合作用的原核自養(yǎng)生物，除了參與光合作用的結(jié)構(gòu)、組分與高等植物類似，其光能轉(zhuǎn)化效率顯著高于后者；此外，藍(lán)藻還具有結(jié)構(gòu)簡單、代時短及易于基因操作的優(yōu)點，使其一直是研究光合作用的理想模式生物。近20年來，由于溫室氣體CO2排放日益加劇，迫切需要實現(xiàn)對CO2資源化利用，這使得藍(lán)藻成為利用CO2生物合成化學(xué)品的理想底盤細(xì)胞，其中最常用的有集胞藻(Synechocystis sp.)6803、聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002、速生聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942和速生聚球藻UTEX 2973。到目前為止，在各國科學(xué)家共同努力下，通過對藍(lán)藻進(jìn)行代謝工程改造，已有近30種化學(xué)品可在藍(lán)藻中實現(xiàn)由CO2直接合成，如乙醇、丁醇等燃料；丙酮、異丙醇、乳酸、乙醇酸等大宗化學(xué)品；異戊二烯、檸檬烯、法尼烯等萜烯類化合物和其他高附加值化學(xué)品。但相較于異養(yǎng)微生物，光合自養(yǎng)微生物藍(lán)藻生長慢，使光合自養(yǎng)藍(lán)藻利用CO2產(chǎn)化學(xué)品的產(chǎn)率與異養(yǎng)微生物利用葡萄糖產(chǎn)化學(xué)品間有百倍的差距，藍(lán)藻光合固碳產(chǎn)化學(xué)品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展因此嚴(yán)重受限。
近年來，隨著生長速率與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接近的速生藍(lán)藻相繼被發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻光合固碳產(chǎn)化學(xué)品領(lǐng)域迎來了希望。2015年，研究人員首次報道了速生藍(lán)藻，即從聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 6301中分離到的速生聚球藻UTEX 2973，其生長速率約是聚球藻6301和聚球藻7942生長速率的2倍以上，但3株藻在基因組層面上的序列相似性超過99.0%，當(dāng)培養(yǎng)條件優(yōu)化為500μmol/(m2·s)、41℃、3.0%CO2時，速生聚球藻UTEX 2973的倍增時間可縮短至2.1 h，接近釀酒酵母的生長速率。隨后又有幾株耐高光的速生藍(lán)藻相繼被分離到，其中聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 11801、聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 11802及聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 11901在光強(qiáng)750μmol/(m2·s)和1 000μmol/(m2·s)培養(yǎng)條件下仍可生長；目前發(fā)現(xiàn)的4株速生藍(lán)藻均為聚球藻，雖然基因組測序顯示，這4株速生藍(lán)藻和聚球藻7942的序列相似性超過80.0%，其中速生聚球藻UTEX 2973與聚球藻7942的相似性甚至超過99.8%，但在高光利用和生長速率方面，這4株速生藍(lán)藻都明顯優(yōu)于聚球藻7942。
在所有模式藍(lán)藻中集胞藻6803的基因組序列最早被公布，因此研究者們對該藻開展了大量研究工作。清晰的遺傳背景、易于基因操作、性狀穩(wěn)定等優(yōu)勢，也使其成為利用CO2生產(chǎn)化學(xué)品的理想底盤細(xì)胞。目前已有光合固碳產(chǎn)化學(xué)品做到規(guī)?；瘻y試階段的報道，如集胞藻6803以CO2為原料產(chǎn)乙醇項目，產(chǎn)量已達(dá)到1 000 L/d。因此，集胞藻6803是極具工業(yè)化應(yīng)用潛力的藍(lán)藻藻株。但目前發(fā)現(xiàn)的速生藍(lán)藻均屬于聚球藻屬，尚無速生集胞藻的報道。
為得到速生集胞藻，我們根據(jù)國內(nèi)外現(xiàn)有4株速生聚球藻都具有高光強(qiáng)下快速生長這一特質(zhì)，利用高光強(qiáng)條件對實驗室常用的集胞藻6803進(jìn)行高光馴化培養(yǎng)。幸運(yùn)的是，經(jīng)約1年的培養(yǎng)馴化，我們得到1株可在900μmol/(m2·s)高光培養(yǎng)條件下快速生長的集胞藻6803，其生長速率明顯快于野生型6803，我們將其命名為高光6803。本研究以期為探究高光6803的耐高光機(jī)制及其耐高光、快速生長性狀的穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)，這不僅能夠拓展速生藍(lán)藻的種屬范圍，還能為藍(lán)藻光合固碳產(chǎn)化學(xué)品的研究提供優(yōu)質(zhì)、高效的底盤細(xì)胞，所得的新認(rèn)識可為將其他種屬藍(lán)藻改造為速生藍(lán)藻的研究提供參考。
2結(jié)果與分析
2.1高光對高光6803生長的影響
為研究高光6803耐高光速生表型的穩(wěn)定性，我們首先比較了高光6803和野生型6803在高光下的生長狀況。
如圖1A所示，在900μmol/(m2·s)高光條件下培養(yǎng)1 d后，相較于野生型6803(0.71±0.02)，高光6803菌液不僅顏色更深、更綠，而且OD730數(shù)值也高2.3倍(2.36±0.05)。如圖1B所示，在接下來的培養(yǎng)過程中，2株集胞藻的OD730、生長速率差異繼續(xù)擴(kuò)大，在第3天，高光6803的OD730(6.98±0.26)是野生型6803(0.78±0.03)的8.9倍；在第6.5天，高光6803的生長速率增長已趨緩，但仍明顯高于野生型6803。
在900μmol/(m2·s)高光條件下，野生型6803表現(xiàn)出生長受限；高光6803仍保持著快速生長的狀態(tài)，未受到高光抑制。經(jīng)計算后可知，本研究中高光6803的最短倍增時間是3.1 h，野生型6803的倍增時間是6.9 h，前者是后者的44.9%，是論文報道的野生型6803最短倍增時間6.6 h的47.0%。以上結(jié)果證明了高光6803可利用高光快速生長。
圖1在高光900μmol/(m2·s)下高光6803與野生型6803培養(yǎng)1d的菌液比較(A)與生長曲線(B)HL6803：高光6803；WT6803：野生型6803；OD730：藻液在730 nm處測得的光密度。
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