呼寧散對雞肺源大腸桿菌生長曲線、細胞壁的影響及抑制效果——討論、結(jié)論
3討論
雞呼吸道疾病綜合征的病原體復(fù)雜多樣，大腸桿菌是該病最常見的細菌性病原體之一。雞大腸桿菌感染在中獸醫(yī)上屬濕熱證，其感染所致的雞呼吸道疾病綜合征在中獸醫(yī)被歸類于“上感”癥狀的范疇，治療時應(yīng)著重于瀉肺平喘、恢復(fù)肺氣的暢達與宣降、消炎抑菌、清熱解毒及增強免疫力等。因此，本試驗在該病的中獸醫(yī)病因分析基礎(chǔ)上，根據(jù)“辨證施治”基本原則，篩選出桑白皮、黃芩、蒲公英、甘草等10味中草藥，按照“君臣佐使”配伍原則進行了合理組方。便攜的中藥劑型在當前中獸藥市場更受消費者青睞，本研究將方中藥材依次進行浸泡、煎煮得到湯劑，再通過濃縮、凍干、粉碎后得到呼寧散，在不改變藥效的前提下，改變了湯劑的物理性狀，可延長中藥的保質(zhì)期，且方便攜帶、保存和使用。
抑菌試驗結(jié)果是抗菌藥物最基本的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，常用的方法有紙片擴散法、牛津杯法、二倍稀釋法及TTC法等。在抑菌試驗中MIC和MBC是重要指標，能抑制試驗菌生長的最低藥物稀釋度為該藥的MIC，能夠殺滅試驗菌的最低藥物稀釋度為該藥的MBC。同時細菌生長情況可以通過繪制生長曲線進行了解。高瑞芳等通過測定細菌生長曲線檢測到香青蘭提取物對大腸桿菌具有抑菌活性。本試驗選用的牛津杯法結(jié)果顯示雞肺源大腸桿菌對呼寧散中度敏感，TTC法測得呼寧散對雞肺源大腸桿菌的MIC為250 mg·mL-1，MBC為500 mg·mL-1，且細菌生長曲線結(jié)果也顯示呼寧散在0~24 h內(nèi)均可抑制該菌株的生長，表明呼寧散對雞肺源大腸桿菌具有顯著的抑制效果。
細菌的細胞膜和細胞壁之間存在AKP，當細胞壁受到破壞后，AKP會由胞內(nèi)泄漏到胞外，可以通過檢測胞外AKP含量(或活性)以確定細胞壁的完整性。正常情況下蛋白質(zhì)、核酸等大分子無法通過細胞膜屏障，當細胞膜通透性受到破壞時，胞內(nèi)物質(zhì)外溢會導(dǎo)致胞外蛋白、核酸濃度升高，不利于細菌成長。劉琳等通過電導(dǎo)率檢測儀檢測到石榴皮水提物作用于大腸桿菌3 h后，菌液中AKP含量顯著增加，表明石榴皮水提物能破壞大腸桿菌細胞壁。Wang等采用酶標儀檢測大腸桿菌核酸的外滲水平，結(jié)果顯示細菌紫外吸收率顯著增加，證明野胡麻破壞了大腸桿菌的細胞膜完整性。本試驗通過檢測雞肺源大腸桿菌培養(yǎng)液中AKP活性、可溶性蛋白及核酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼寧散作用于細菌12 h時，1/2 MIC組和MIC組培養(yǎng)液中AKP、可溶性蛋白及核酸含量均顯著增加，表明呼寧散可破壞雞肺源大腸桿菌的細胞壁和細胞膜而發(fā)揮抑菌作用。
LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，也是病原菌最為重要的模式分子，可誘導(dǎo)嚴重的炎癥反應(yīng)，激活細胞產(chǎn)生多種炎癥因子，從而引起一系列的病變，常用來代替大腸桿菌誘導(dǎo)炎癥動物或細胞模型。DF-1細胞為可傳代的雞成纖維細胞系常用以研究禽類病原體對細胞的損傷，因此本試驗選取LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞模型來探究呼寧散的體外抗炎和抗氧化作用。CCK-8溶液中的WST-8在電子耦合試劑存在時，可被細胞中的脫氫酶還原為黃色，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系，因此本試驗利用這一特性進行細胞增殖和細胞毒性測定，確定了呼寧散低、中、高劑量組的給藥濃度分別為1.5、2、2.5 mg·mL-1，LPS誘導(dǎo)DF-1細胞損傷的建模濃度為40 mg·mL-1，為后續(xù)體外試驗奠定了基礎(chǔ)。
TLR4/NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)過程中起著關(guān)鍵性作用。LPS與TLR4配體結(jié)合激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等分泌，引起機體炎癥反應(yīng)。IL-1β大量產(chǎn)生于炎癥初期，促進炎癥反應(yīng)。IL-6是促炎因子，能與靶細胞表面IL-6受體結(jié)合成復(fù)合物，調(diào)控炎癥細胞因子的表達。IL-8也是常見的促炎因子，參與炎癥感染時各種細胞的相互作用。大量研究表明，中藥能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路中的炎癥因子從而緩解炎癥狀態(tài)。本試驗通過ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6和IL-8的含量，進一步地通過Western blot法測定TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白TLR4、NF-κB p65的表達量，結(jié)果證實呼寧散可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路來抑制炎癥因子的過度分泌，從而減輕LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞炎癥反應(yīng)。
體內(nèi)感染通常會產(chǎn)生大量的超氧陰離子，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。氧化應(yīng)激是指細胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致平衡傾向于過氧化狀態(tài)。研究表明，LPS可通過激活促炎細胞因子產(chǎn)生大量的ROS，進而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。當ROS過量時，多余的ROS會攻擊體內(nèi)組織，導(dǎo)致細胞的損傷和衰老。MDA是膜脂過氧化重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷，是評價氧化應(yīng)激的重要指標。SOD是機體內(nèi)天然自由基消除劑，能催化機體內(nèi)超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，是檢測抗氧化能力的指標之一。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)，排泄出體外，反映了組織抵抗氧化損傷的能力。Wang等研究表明，LPS可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起雞肝臟細胞變性和壞死，增加體內(nèi)ROS和MDA的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化損傷。本試驗通過相關(guān)試劑盒檢測ROS、MDA、SOD、GSH含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼寧散可降低DF-1細胞中氧化應(yīng)激標志物ROS和MDA的含量，提高抗氧化物SOD和GSH的水平。Keap1/Nrf2通路是抵御氧化應(yīng)激的主要防御機制，Nrf2是一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過調(diào)控下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)抗氧化酶的生成，從而調(diào)節(jié)細胞或機體的抗氧化能力。正常情況下Nrf2與Keap1相結(jié)合，氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2與Keap1解離而活化，進一步激活下游抗氧化基因和細胞保護基因的表達，主要包括HO-1、NQO1、GSH等。本試驗進一步通過Western blot法測定了Keap1/Nrf2信號通路關(guān)鍵蛋白Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼寧散可明顯降低Keap1蛋白表達量，上調(diào)Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達量，表明呼寧散可通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路提高DF-1細胞的抗氧化能力，從而有效緩解LPS所致的氧化損傷。
4結(jié)論
呼寧散對雞肺源大腸桿菌具有良好的抑菌活性，并且可通過調(diào)控LPS誘導(dǎo)的DF-1細胞TLR4/NF-κB、Keap1/Nrf2信號通路發(fā)揮抗炎、抗氧化能力，為臨床用于防治雞肺源大腸桿菌及雞呼吸道疾病綜合征藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
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