孢漢遜酵母、美極梅奇酵母等菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定及釀酒因子耐受性分析（一）
現(xiàn)代葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)為了實(shí)現(xiàn)釀造過(guò)程的良好管理并提高發(fā)酵效率，大多采用單一商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行酒精發(fā)酵，導(dǎo)致葡萄酒的風(fēng)格同質(zhì)化嚴(yán)重，缺乏產(chǎn)區(qū)風(fēng)土特色。然而，事實(shí)上葡萄酒發(fā)酵是由多種屬微生物等共同完成的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。源自葡萄果皮的非釀酒酵母（non-Saccharomyces yeast，NS）菌株在酒精發(fā)酵前期占主導(dǎo)地位，至中、后期才由于酒精耐受性較差以及與釀酒酵母的相互作用，逐漸被S.cerevisiae取代。越來(lái)越多的研究表明，適應(yīng)了產(chǎn)區(qū)風(fēng)土的NS菌株具有獨(dú)特的釀造學(xué)特性，在酒精發(fā)酵過(guò)程中會(huì)改變葡萄酒中可滴定酸和乙醇含量、增加甘油含量、釋放甘露糖蛋白、修飾花色苷、提高揮發(fā)性香氣化合物種類及含量，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)和感官特征多元化具有積極貢獻(xiàn)。此外，部分NS菌株還可以分泌與葡萄酒香氣轉(zhuǎn)化釋放相關(guān)的風(fēng)味酶，促進(jìn)萜烯類、酯類和醇類物質(zhì)的釋放或合成，對(duì)改善酒體的香氣風(fēng)格和典型性具有重要意義。
葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）是目前研究和應(yīng)用最多的葡萄酒相關(guān)NS菌種。MU?OZ-REDONDO等發(fā)現(xiàn)，T.delbrueckii與釀酒酵母混菌發(fā)酵，降低了葡萄酒中乙醇及部分中鏈脂肪酸乙酯的含量，但能增加部分重要酯類化合物含量，對(duì)提高桃紅葡萄酒香氣復(fù)雜性具有重要貢獻(xiàn)；接種M.pulcherrima進(jìn)行發(fā)酵的葡萄酒中酯類物質(zhì)、花青素和單寧含量增加，乙醛含量降低。ZHANG等的研究中發(fā)現(xiàn)本土H.uvarum參與發(fā)酵可使‘赤霞珠’葡萄酒的乙酯含量增加48.54%～59.55%、而‘霞多麗’葡萄酒中的乙酯含量提高了96.94%～110.92%。整體而言，現(xiàn)階段有關(guān)NS菌株的研究主要集中于其和S.cerevisiae的隨機(jī)組合發(fā)酵對(duì)葡萄酒化學(xué)組分的影響，但對(duì)不同種屬本土NS菌株在純種發(fā)酵條件下的釀造學(xué)差異分析還十分欠缺，致使釀酒師無(wú)法按照葡萄漿果狀態(tài)和釀造意愿充分呈現(xiàn)NS對(duì)葡萄酒應(yīng)有的特定貢獻(xiàn)。因此，急需深入明晰特定NS菌株的獨(dú)有釀造學(xué)特性，為靶向設(shè)計(jì)S.cerevisiae與NS的混菌發(fā)酵策略奠定基礎(chǔ)。
本試驗(yàn)以篩選自中國(guó)河西走廊葡萄產(chǎn)區(qū)的葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）HX-1、HX-3，美極梅奇酵母（M.pulcherrima）HX-2、HX-4和戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii）HX-6、HX-7為供試菌株，以菌株的生長(zhǎng)曲線和釀酒因子耐受性分析為基礎(chǔ)，進(jìn)行‘美樂(lè)’葡萄汁純種發(fā)酵試驗(yàn)；系統(tǒng)分析其發(fā)酵特點(diǎn)和產(chǎn)香性能，揭示本土NS菌株的釀造學(xué)特性差異，以期為科學(xué)選擇混菌發(fā)酵劑組合和接種策略、定向改善葡萄酒感官風(fēng)格提供有益借鑒和參考。
1.材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
6株NS菌株均篩選自河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵葡萄酒樣。通過(guò)26S rDNA D1/D2鑒定，確定菌株HX-1、HX-3為H.uvarum，HX-2、HX-4為M.pulcherrima，HX-6、HX-7為T.delbrueckii，具有良好的葡萄酒/果酒釀造應(yīng)用潛力。?80℃甘油管保存藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院葡萄酒微生物實(shí)驗(yàn)室。
YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L，121℃高壓（103.4 kPa）滅菌20 min。
WL培養(yǎng)基：購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。稱樣80.25 g，加入1 000 mL蒸餾水。115℃高壓（70 kPa）滅菌20 min。
‘美樂(lè)’葡萄：2023年9月采自甘肅莫高葡萄酒廠種植基地，還原糖含量229.63 g/L、可滴定酸（以酒石酸計(jì)）含量5.65 g/L、pH值為3.61。
1.2菌株活化
保藏在甘油管中的各非釀酒酵母分別在YPD液體培養(yǎng)基中28℃活化培養(yǎng)48 h，隨后將菌液稀釋涂布于WL固體培養(yǎng)基再次28℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中28℃進(jìn)行擴(kuò)培增殖，生物量達(dá)到106 cfu/mL時(shí)，備用接種。
1.3生長(zhǎng)特性測(cè)定
1.3.1非釀酒酵母生長(zhǎng)曲線
采用YPD培養(yǎng)基能夠保證酵母生長(zhǎng)的穩(wěn)定性和一致性，真實(shí)反映供試菌株的生長(zhǎng)狀況。將各供試菌株以1×106 cfu/mL接種于YPD液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)。每隔4 h測(cè)定菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下的OD值。各試驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取平均值繪制生長(zhǎng)曲線。
1.3.2釀造因子耐受性分析
將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的供試菌株，以1×106 cfu/mL依次分別接種于pH值為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0，乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%、6%、9%、12%和15%，SO2質(zhì)量濃度為50、100、150、200和300 mg/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為100、150、200、250和300 g/L的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，采用分光光度法測(cè)定OD600值。此外，將供試菌株以1×106 cfu/mL接種于YPD液體培養(yǎng)基，分別置于10、15、20、28和35℃條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期后測(cè)定OD600值，分析不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。各處理組均包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，下同。
1.3.3絮凝試驗(yàn)
供試菌株在YPD培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)48 h后，6 000×g離心8 min，除去上清液。將酵母細(xì)胞用含5 mmol/L EDTA和50 mmol/L檸檬酸鈉的緩沖液（pH值為3）洗滌2次并置于緩沖液中，細(xì)胞濃度控制在5×107 cfu/mL。取5 mL懸浮液中加入20 mmol/L CaCl2，25℃下50 r/min振蕩試管5 min以誘導(dǎo)絮凝。取200μL上清液加入1 mL 250 mmol/L的EDTA，每30 s測(cè)量吸光度OD600，持續(xù)10 min。以未添加CaCl2的酵母細(xì)胞懸浮液作為對(duì)照。
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