不同溫度下金屬螯合劑對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)曲線的影響（二）
2.2 碳源物質(zhì)對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶表達(dá)的影響
在培養(yǎng)基中分別添加1%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等不同碳源, 在28 °C培養(yǎng)24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加1%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖均不同程度地促進(jìn)菌體的生長(zhǎng),但對(duì)蛋白酶的分泌有一定的抑制作用（表1）。
表1 不同碳源物質(zhì)對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶活力的影響| 碳源 | W-1相對(duì)菌濃度（%） | W-1相對(duì)酶活力（%） |
|---|---|---|
| 對(duì)照 | 100 | 100 |
| 1%葡萄糖 | 175 | 77.87 |
| 1%蔗糖 | 130 | 79.64 |
| 1%麥芽糖 | 128 | 98.64 |
2.3 抗生素對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)和蛋白酶表達(dá)的影響
從表2可以看出，添加不同濃度的氨芐青霉素對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白酶活力的表達(dá)均有抑制作用，而且高濃度氨芐青霉素 (50,100 mg/L)的抑制作用顯著（P <0.05）。
表2 不同質(zhì)量濃度氨芐青霉素對(duì)鰻弧菌W-1生長(zhǎng)及酶活力的影響| 氨芐青霉素質(zhì)量濃度(mg/L) | 相對(duì)菌濃度（%） | 相對(duì)酶活力（%） |
|---|---|---|
| 0 | 100 | 100 |
| 10 | 78.90 | 82.37 |
| 50 | 45.37 | 26.65 |
| 100 | 42.07 | 14.67 |
2.4 金屬螯合劑對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)及胞外蛋白酶表達(dá)的影響
如圖2所示，1 mmol/L EDTA對(duì)于鰻弧菌W-1的生長(zhǎng)和胞外蛋白酶的表達(dá)均有極顯著的抑制作用（P<0.01）；1 mmol/L 的EGTA對(duì)鰻弧菌W-1生長(zhǎng)和胞外蛋白酶表達(dá)沒(méi)有顯著影響（P >0.05）。
圖2 金屬螯合劑對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)及蛋白酶表達(dá)的影響
3 討論
環(huán)境溫度對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有較大影響，鰻弧菌W-1在2216E海水培養(yǎng)基中，15,28,37 °C條件下培養(yǎng)均能生長(zhǎng)，其中在28 °C時(shí)的生長(zhǎng)和胞外蛋白酶活力最高，表明28 °C為鰻弧菌的最適合生長(zhǎng)溫度；在15 °C條件下，鰻弧菌生長(zhǎng)和胞外蛋白酶的表達(dá)有一定的降低，但差異不顯著，在較高溫度（37 °C）下，菌體生長(zhǎng)和胞外蛋白酶的表達(dá)均受到顯著的抑制，這與鰻弧菌生長(zhǎng)自然環(huán)境相一致，鰻弧菌在中國(guó)北方海水養(yǎng)殖動(dòng)物和海水環(huán)境中較為普遍，而北方地區(qū)沿海的水溫度變化范圍在12~30 °C左右。
進(jìn)一步分析鰻弧菌W-1在28 °C時(shí)的生長(zhǎng)曲線和胞外蛋白酶的分泌，發(fā)現(xiàn)從6~21 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在24 h時(shí)候菌濃度均達(dá)到最大；胞外蛋白酶的分泌隨著菌體的生長(zhǎng)逐漸升高,并在24 h達(dá)最大分泌量,約36 h后緩慢下降，其蛋白酶的分泌跟菌體的生長(zhǎng)基本同步；而Croxatto等的研究表明，鰻弧菌蛋白酶的分泌受密度調(diào)控基因的控制，只有當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定范圍時(shí)，鰻弧菌才開(kāi)始分泌蛋白酶。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等碳源物質(zhì)均能顯著促進(jìn)鰻弧菌的生長(zhǎng)，其中以葡萄糖作用最明顯，蔗糖和麥芽糖次之，而胞外蛋白酶活力則明顯下降，說(shuō)明蛋白酶產(chǎn)生受代謝阻遏系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。
糖類對(duì)蛋白酶產(chǎn)生抑制,可能是菌體在具有充足的能量物質(zhì)時(shí)減少蛋白酶的分泌，而當(dāng)缺乏糖類等碳源時(shí)，細(xì)菌可分泌胞外蛋白酶以水解環(huán)境中的蛋白類物質(zhì)，獲得小肽、氨基酸等作為氮源、碳源等能量物質(zhì)，滿足其生長(zhǎng)的需要。Long 等在溶藻膠弧菌中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。EDTA可以螯合革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜中磷酸鹽殘基和脂多糖分子中的Mg2+和Ca2+，并可以螯合細(xì)胞膜上通道蛋白中的Mg2+和Ca2+，從而直接影響細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。
Michelle 等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度EDTA對(duì)于O2血清型鰻弧菌的生長(zhǎng)有抑制作用和細(xì)胞毒性作用，0.6~5 mmol/L的EDTA明顯抑制O2血清型鰻弧菌大部分蛋白質(zhì)的表達(dá)。在本研究中添加1mmol/L金屬離子螯合劑EDTA后，鰻弧菌W-1菌體生長(zhǎng)及胞外蛋白酶的分泌均受到顯著的抑制，這與Michelle 等的研究結(jié)果相一致。EGTA是一種鈣離子螯合劑，但EGTA的加入對(duì)于鰻弧菌W-1的生長(zhǎng)和胞外蛋白酶表達(dá)沒(méi)有顯著影響，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
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