百里香酚MIC和生長曲線測定及對金葡菌Hla的作用機制（三）
2.3百里香酚對金葡菌Hla的影響
金葡菌USA300在穩(wěn)定期能夠產(chǎn)生Hla并分泌至培養(yǎng)液中，Hla對兔紅細胞敏感，從而發(fā)生溶血現(xiàn)象。若細菌培養(yǎng)液的溶血能力下降，則說明Hla的含量減少或者生物活性受到抑制。本試驗以不加百里香酚組的溶血能力為100%，當百里香酚質(zhì)量濃度為16μg/mL和32μg/mL時，溶血能力分別下降至51.9%±3.7%和34.8%±2.6%，差異極顯著(P<0.01)(圖2a)。接著通過蛋白免疫印跡試驗考察溶血能力下降的原因，結(jié)果顯示：隨著百里香酚質(zhì)量濃度的增加，Hla蛋白條帶的顏色明顯減弱，說明Hla的含量減少(圖2b)。Hla的編碼基因為hla，RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄與Hla表達呈正相關(guān)關(guān)系。RT-PCR結(jié)果表明：不同質(zhì)量濃度的百里香酚對USA300的hla和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白免疫印跡的結(jié)果基本一致，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，hla和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平都降低。當百里香酚質(zhì)量濃度為32μg/mL時，與對照組相比hla和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平分別下降至5.5%±3.0%和10.5%±2.1%，差異極顯著(P<0.01)(圖2c)。
圖2百里香酚對金葡菌Hla的影響
注：a)不同質(zhì)量濃度百里香酚與金葡菌培養(yǎng)上清液對兔紅細胞的溶血作用；b)不同質(zhì)量濃度百里香酚對金葡菌USA300 Hla表達影響的免疫印跡結(jié)果；c)不同濃度的百里香酚對金葡菌USA300的hla和RNAⅢ相對基因表達量的影響。*.P<0.05，**.P<0.01；下同。
2.4百里香酚對金葡菌USA300α-溶血素介導的人肺癌上皮細胞A549損傷的保護作用
通過Live/Dead試劑盒染色，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到綠色熒光的為活細胞，紅色熒光的為死細胞。試驗結(jié)果表明：百里香酚可以提高由金葡菌Hla介導的A549細胞損傷的保護率(圖3a~d)，隨著百里香酚質(zhì)量濃度的增加，死細胞數(shù)量減少，活細胞數(shù)量增加。
圖3不同質(zhì)量濃度百里香酚對金葡菌USA300介導的A549細胞損傷的保護作用
注：a)未處理組；b)感染金葡菌USA300組；c)感染金葡菌USA300，并加入百里香酚使其質(zhì)量濃度為8μg/mL；d)感染金葡菌USA300，并加入百里香酚使其質(zhì)量濃度32
乳酸脫氫酶(LDH)是胞內(nèi)酶，在細胞壞死破裂后釋放到細胞外。本研究通過檢測細胞培養(yǎng)基上清液中LDH的釋放量，定量分析百里香酚對α-溶血素介導的A549細胞的保護作用。隨著百里香酚質(zhì)量濃度的增加，LDH的釋放量降低，在質(zhì)量濃度為4、8、16和32μg/mL時LDH的釋放量分別為80.8%±4.8%、43.3%±5.0%、26.8%±4.0%和4.8%±2.5%(圖3e)。以上結(jié)果說明百里香酚具有保護金葡菌Hla介導的A549細胞損傷的作用，且與藥物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。
3.討論
α-溶血素(Hla)是細菌生長后期所分泌的一種外毒素，大小約為33 ku，多種細胞(紅細胞、單核細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞)的細胞膜對Hla敏感。Hla可在敏感細胞的細胞膜上形成中空的七聚體圓柱體，貫穿細胞膜形成孔道，破壞其完整性，從而破壞細胞內(nèi)物質(zhì)的平衡，最終導致細胞裂解引起多種疾病。已有文獻報道Hla在金葡菌肺炎的致病過程中起非常關(guān)鍵性的作用。因此，可將Hla作為抗金葡菌肺炎的新靶點。眾所周知，傳統(tǒng)的抗生素主要是通過阻礙細菌的生長和增殖達到抗菌效果，如抑制細胞壁的合成、破壞細胞膜、阻斷DNA復制、干擾細菌代謝以及抑制蛋白質(zhì)的合成等。傳統(tǒng)抗生素能有效地治療細菌感染，但是其對細菌產(chǎn)生選擇性壓力，使細菌產(chǎn)生耐藥性。使用抗生素治療金葡菌感染極易產(chǎn)生耐藥性。而Hla是細菌生長的非必需物質(zhì)，抑制其表達或者生物活性不會給細菌的生長造成選擇性壓力，因而不易產(chǎn)生耐藥性，在抗生素耐藥性如此嚴重的今天具有重要意義。
本研究中，百里香酚在亞抑菌質(zhì)量濃度下對金葡菌的生長沒有影響，但是卻能通過下調(diào)hla和RNAIII的轉(zhuǎn)錄水平使Hla的表達量下降，是一種潛在的抗Hla的藥物。目前抗Hla藥物還處于試驗研究階段，抗生素仍然是治療金葡菌肺炎的主流?？梢钥紤]與抗生素聯(lián)用增加效果，這一聯(lián)用思路主要是抗生素抑菌或者殺菌，抗Hla藥物抑制Hla可能會有更好的效果。另外，某些抗生素(如β-內(nèi)酰胺和氟喹諾酮類抗生素)在亞抑菌濃度下會增加Hla的表達，該類抗生素與抗Hla藥物聯(lián)用后可以彌補抗生素的不足。Hla的表達量增加還會增加其他細菌(尤其是革蘭陰性菌)的生長繁殖，加重肺炎感染的癥狀。因此，抗生素與抗Hla藥物聯(lián)用在未來是一個非常受關(guān)注的熱點。
4.結(jié)論
百里香酚通過下調(diào)金葡菌的hla和RNAIII的轉(zhuǎn)錄水平降低Hla的表達，并對金葡菌Hla介導的肺癌上皮細胞A549的損傷具有保護作用，這提示抑制Hla的表達對治療金葡菌肺炎具有潛在的效果，至于效果如何還有待進一步研究。本研究尚未對百里香酚的安全性進行評價，這將是接下來要研究的內(nèi)容。USA300菌株為MRSA菌株，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)百里香酚對該菌株也有抑菌效果，但對其他耐藥菌株是否同樣有效果還需進一步研究。百里香酚與β-內(nèi)酰胺和氟喹諾酮類抗生素聯(lián)用增加治療效果還有待于深入研究。
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