?微生物農(nóng)藥之綠僵菌（Metarhizium anisopliae）計(jì)數(shù)及登記
綠僵菌屬于球殼菌目麥角菌科，是一類昆蟲病原絲狀真菌，最早由Metschnikoff于1879年發(fā)現(xiàn)并命名。其菌落初期呈白色茸狀，產(chǎn)孢階段中央形成綠色至灰黑色的分生孢子堆，基質(zhì)反面呈淡褐色或赭色。分生孢子單細(xì)胞、鏈狀排列，形態(tài)為長橢圓形或圓柱形（3.0-5.0μm×1.0-2.0μm），與白僵菌的球形孢子顯著不同。
綠僵菌屬包含12個(gè)種，其中農(nóng)業(yè)應(yīng)用最廣泛的是金龜子綠僵菌（M.anisopliae）、黃綠綠僵菌（M.flavoviride）、平沙綠僵菌（M.pingshaense）等。其最適生長溫度為24-26℃（10-30℃均可發(fā)育），最適pH 6.9-7.4，耐受pH 4.7-10。分生孢子在干燥條件下可保存3年以上，但60℃高溫會(huì)迅速失活。
作為重要的生物防治資源，綠僵菌通過侵染害蟲體壁實(shí)現(xiàn)殺蟲效果，對(duì)鱗翅目、鞘翅目等700余種農(nóng)業(yè)害蟲具有廣譜活性，且對(duì)人畜低毒、環(huán)境友好，是替代化學(xué)農(nóng)藥的關(guān)鍵微生物資源。
綠僵菌生物農(nóng)藥的檢驗(yàn)檢測方法
1.鑒別方法
形態(tài)學(xué)鑒定：
菌落特征：觀察橄欖綠色孢子層及鏈狀孢子排列。
顯微特征：光學(xué)顯微鏡下（400×/1000×）確認(rèn)分生孢子形態(tài)（橢圓形/圓柱形）及鏈狀排列模式（區(qū)別于白僵菌的球形孢子）。
分子生物學(xué)鑒定：
ITS序列分析：通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1-5.8S-ITS2）序列比對(duì)區(qū)分種間差異。
EF1-α基因測序：延伸因子1-α基因（EF1-α）用于菌株級(jí)分類。
PCR分子標(biāo)記：檢測特異性基因片段（如tekh*基因）。
質(zhì)譜分析：
MALDI-TOF MS：通過蛋白質(zhì)指紋圖譜快速鑒定菌株特征。
2.效價(jià)測試
活孢子數(shù)測定（稀釋涂布平板法）：
1.樣品制備：取10g（或10mL）制劑加入90mL無菌0.05%吐溫-80鹽水，振蕩30min制成10?1懸液。
2.梯度稀釋：依次稀釋至10??、10??、10??梯度。
3.培養(yǎng)計(jì)數(shù)：取0.1mL稀釋液涂布PDA平板，25-28℃避光培養(yǎng)3-5d，選取菌落數(shù)30-300的平板計(jì)數(shù)。
4.計(jì)算公式：活孢子數(shù)（CFU/g/mL）=平板平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10（0.1mL換算系數(shù)）。
孢子萌發(fā)率檢測（載玻片培養(yǎng)法）：
1.懸液制備：調(diào)整孢子濃度至1×10?-1×10?CFU/mL。
2.培養(yǎng)觀察：5μL懸液滴加至SDAY培養(yǎng)基載玻片上，25-28℃培養(yǎng)24-48h。
3.萌發(fā)判定：顯微鏡下統(tǒng)計(jì)“芽管長度＞孢子直徑1/2”的萌發(fā)孢子占比，計(jì)算萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)）×100%。
生物活性測定：
靶標(biāo)害蟲毒力實(shí)驗(yàn)：通過浸漬法或噴霧法處理害蟲（如番茄潛葉蛾），測定半致死濃度（LC??）和半致死時(shí)間（LT??）。
3.質(zhì)量控制
雜菌檢測：參照GB/T 19567.2-2023，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)48h后統(tǒng)計(jì)非目標(biāo)菌落數(shù)（污染率≤1%）。
理化指標(biāo)：pH值（6.0-7.5）、水分含量（粉劑＜8%）、懸浮率（≥70%）。
安全性評(píng)估：對(duì)非靶標(biāo)生物（如天敵昆蟲）及環(huán)境無顯著負(fù)面影響。
登記查詢
中國
在中國，綠僵菌屬于微生物農(nóng)藥，需經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所登記。已有多種商品化制劑（如綠僵菌可濕性粉劑、懸浮劑等）獲得農(nóng)藥登記證，用于防治蝗蟲、白蟻等：其中：
針對(duì)蝗蟲的登記制劑（如200億CFU/g可濕性粉劑）主要用于內(nèi)蒙古、新疆等草原蝗區(qū)的防治，年應(yīng)用面積超過1000萬畝；
針對(duì)白蟻的登記制劑（如100億CFU/mL懸浮劑）廣泛應(yīng)用于房屋建筑、園林樹木的白蟻防治，替代傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲劑（如氯菊酯）；
針對(duì)蠐螬的登記制劑（如300億CFU/g微膠囊劑）在東北玉米產(chǎn)區(qū)、華北花生產(chǎn)區(qū)的應(yīng)用面積逐年擴(kuò)大，2023年應(yīng)用面積超過500萬畝。
歐盟
歐盟對(duì)微生物農(nóng)藥的管理由歐盟農(nóng)藥法規(guī)(Regulation(EC)No 1107/2009)管轄。Metarhizium anisopliae特定菌株（如Metarhizium anisopliae var.anisopliae BIPESCO 5/F52）已被列入歐盟批準(zhǔn)清單，可作為活性物質(zhì)使用。
美國
在美國，綠僵菌制劑由EPA管理，歸類為生物農(nóng)藥（Biopesticides）。部分菌株（如Metarhizium anisopliae strain F52）已獲EPA登記，用于農(nóng)田害蟲與草坪害蟲的防治,以下是具體信息：
草坪害蟲防治：strain F52制劑用于防治高爾夫球場、公園草坪的蠐螬（如日本金龜子幼蟲），施藥后防效可達(dá)80%以上，且對(duì)草坪草無藥害；
有機(jī)農(nóng)業(yè)防治：strain ARSEF 3244制劑獲得美國農(nóng)業(yè)部（USDA）的“有機(jī)認(rèn)證”，可用于有機(jī)蔬菜（如lettuce、spinach）、有機(jī)水果（如草莓、藍(lán)莓）的蚜蟲、薊馬防治；
公共衛(wèi)生防治：部分菌株的制劑用于防治城市公園、居民區(qū)的蚊子幼蟲，替代化學(xué)殺蟲劑（如吡蟲啉），減少對(duì)水體生態(tài)的破壞。
以上方法遵循《綠僵菌、白僵菌生物農(nóng)藥檢驗(yàn)操作規(guī)程》（SN/T 2374-2009）及NY/T 1153.6-2013標(biāo)準(zhǔn)，確保產(chǎn)品質(zhì)量與田間防效。
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