特定精油可有效根除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜（二）
其他抗菌精油在殺死銅綠假單胞菌生物膜方面的效果是否與肉桂油一樣？為了回答這個(gè)問(wèn)題，我們根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室和標(biāo)準(zhǔn)研究所的協(xié)議使用MHB瓊脂在盤擴(kuò)散試驗(yàn)中篩選了可以殺死銅綠假單胞菌PAO1的精油。這些精油由Aura Cacia和New Directions Aromatics提供，并被描述為100%純度。每種精油的20微升未經(jīng)稀釋地點(diǎn)在由3層Whatman濾紙制成的濾紙盤上。我們的數(shù)據(jù)表明，以下精油在殺死銅綠假單胞菌方面有效：肉桂、丁香（Syzygium aromaticum）、秘魯香膏（Myroxylon balsamum），紅迷迭香（Thymus vulgaris）和茶樹(shù)（Melaleuca alternifolia）精油（圖2）。為了考慮這些精油可能穿透瓊脂的程度不同，導(dǎo)致看似抗菌效果降低的可能性，任何產(chǎn)生可見(jiàn)抑制區(qū)的精油都被考慮用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖2擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定出具有抗菌活性的精油?？股貪舛葹?0 mg ml?1(A)和純精油(B)被測(cè)試對(duì)銅綠假單胞菌PAO1。產(chǎn)生抑制區(qū)的物質(zhì)進(jìn)一步分析；薰衣草油作為陰性對(duì)照。
在下一步中，我們探討了在盤擴(kuò)散試驗(yàn)中表現(xiàn)出活性的油是否在殺死生物膜方面也有效。為了研究這一點(diǎn)，我們確定了每種油的兩個(gè)參數(shù)：殺死懸浮細(xì)胞所需的最低抑制濃度（MIC）和最小生物膜消除濃度（MBEC）。生物膜是在MBEC裝置（Innovotech Inc.，加拿大埃德蒙頓）上生長(zhǎng)的，這是一個(gè)經(jīng)過(guò)修改的微孔板，蓋子上附有96個(gè)聚苯乙烯釘。釘子浸泡在含有10的MHB培養(yǎng)基中?個(gè)細(xì)胞/ml，37°C和30°C振蕩培養(yǎng)P.aeruginosa PAO1和P.putida KT2440，分別。24小時(shí)后，長(zhǎng)在釘子上的生物膜被沖洗，并按照?qǐng)D3所示，在陽(yáng)離子調(diào)整的MHB中進(jìn)行1:1的抗生素和精油的系列稀釋；稀釋精油的培養(yǎng)基中補(bǔ)充了0.1%的吐溫。挑戰(zhàn)培養(yǎng)基的體積為200μl，測(cè)試的抗生素和精油的最高濃度為100μg ml?1和5%，分別。青霉素和薰衣草分別作為抗生素和精油的陰性對(duì)照。經(jīng)過(guò)2小時(shí)的培養(yǎng)后，將peg洗滌，浸入150μl新鮮的MHB中，并在Branson 2510超聲波發(fā)生器（40 kHz）中超聲10分鐘，以釋放和解離與peg相關(guān)的生物膜。通過(guò)將peg從蓋子上折斷并分別在含有200μl磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）的微量離心管中超聲來(lái)確定每個(gè)peg上的平均細(xì)胞數(shù)。將所得溶液進(jìn)行系列稀釋并接種，以確定CFU。CFU計(jì)數(shù)顯示，每個(gè)peg上的平均細(xì)胞數(shù)為3×10?個(gè)PAO1和4×10?個(gè)。對(duì)于KT2440。為了獲得MIC，每孔加入相同數(shù)量的planktonic細(xì)胞，以抗生素或精油進(jìn)行挑戰(zhàn)。2小時(shí)后，每孔加入20μl到新鮮的MHB中。經(jīng)過(guò)過(guò)夜培養(yǎng)后，確定每種化學(xué)物質(zhì)最低的濃度，以防止生物膜和planktonic細(xì)胞的存活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，確定平均MIC或MBEC。
圖3選定抗生素和抗菌精油對(duì)銅綠假單胞菌PAO1(A,B)和粘細(xì)菌KT2440(C)的活性。通過(guò)挑戰(zhàn)細(xì)菌（無(wú)論是游離狀態(tài)還是在生物膜內(nèi)）來(lái)確定各種物質(zhì)的MIC和MBEC。星號(hào)表示數(shù)據(jù)超出了圖表的范圍，表明在測(cè)試濃度下沒(méi)有觀察到殺傷作用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了三次重復(fù)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖3A和B顯示了每種測(cè)試物質(zhì)的MIC和MBEC。只有單一的抗生素，氧氟沙星，能夠以幾乎相同的效果根除planktonic和生物膜細(xì)菌。其他抗生素，多粘菌素和gentamicin，在濃度比MIC高10倍的情況下，仍然無(wú)法有效殺死生物膜。相比之下，卡西和秘魯香膏的精油在幾乎相同的濃度下對(duì)生物膜和planktonic細(xì)菌有效。這一觀察結(jié)果確認(rèn)了圖1的結(jié)果。對(duì)于肉桂油，觀察到MIC和MBEC差異很小。有趣的是，紅迷迭香油在濃度約為2%時(shí)對(duì)生物膜有效，但在任何測(cè)試濃度下都無(wú)法殺死游離細(xì)胞。這表明迷迭香油對(duì)生物膜的效力比對(duì)溶液中細(xì)菌的效力更高。為了確定統(tǒng)計(jì)顯著性，我們進(jìn)行了單樣本t檢驗(yàn)，將生物膜種群與游離細(xì)胞種群的平均值進(jìn)行比較。由于紅迷迭香的游離細(xì)胞種群在最高測(cè)試濃度下未被殺死，我們使用最大值（5%）作為種群平均值，以查看在該水平上是否可以檢測(cè)到顯著性。確實(shí)，PAO1和KT2440的游離細(xì)胞和生物膜種群之間的差異具有顯著性(P<0.05)，表明紅迷迭香油對(duì)生物膜的抑制效果比對(duì)游離細(xì)胞的效果更好。我們得出結(jié)論，這里測(cè)試的精油對(duì)生物膜的抑制效果比測(cè)試的抗生素更好。
為了測(cè)試精油對(duì)潛在菌株特異性的影響，我們?cè)u(píng)估了它們對(duì)鄰近菌株（KT2440）的影響（圖3C）。我們的數(shù)據(jù)表明鄰近菌株比銅綠假單胞菌對(duì)丁香、紅百里香和茶樹(shù)油更敏感（圖3）。這種效果在丁香油上尤為明顯，丁香油沒(méi)有消除PAO1，但對(duì)KT2440生物膜和懸浮細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用（圖3）。使用單一樣本t檢驗(yàn)比較鄰近菌株和銅綠假單胞菌的丁香油數(shù)據(jù)（假設(shè)銅綠假單胞菌樣本為5%），我們發(fā)現(xiàn)丁香油對(duì)假單胞菌的影響與對(duì)銅綠假單胞菌的影響顯著不同（P<0.05）。此外，紅百里香油在5%的濃度下對(duì)游離細(xì)菌有效，這是測(cè)試的最高濃度，而茶樹(shù)油對(duì)生物膜細(xì)胞有效。由于銅綠假單胞菌在測(cè)試的最高濃度下仍然存活，我們無(wú)法計(jì)算這些情況下的統(tǒng)計(jì)顯著性。兩種假單胞菌這些菌株表明了這些精油對(duì)特定物種的活性，并表明可能有特定的抗性機(jī)制在起作用。例如，由于某些精油似乎作用于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，因此這些細(xì)胞成分的組成可能是決定對(duì)精油敏感性的重要因素。這些精油對(duì)特定物種的活性表明，針對(duì)不同微生物的定制組合可能對(duì)多物種生物膜有效。
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