特定精油可有效根除銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜（一）
生物膜由于其對抗生素的高抗性，難以通過標(biāo)準(zhǔn)的抗菌治療消除。我們在此展示了一些特定的抗菌精油，它們比某些重要抗生素更有效地清除生物膜中的細(xì)菌，這使得它們成為治療生物膜的有趣候選者。
微生物生物膜在臨床和工業(yè)環(huán)境中構(gòu)成了挑戰(zhàn)，因?yàn)閷o菌的需要至關(guān)重要。生物膜中的細(xì)菌比懸浮液中的單個(gè)細(xì)胞對抗生素和消毒劑的抵抗力更強(qiáng)。幾個(gè)機(jī)制可以解釋生物膜中抗生素抗性增加，包括由胞外多聚物形成的物理屏障，一部分對抗生素惰性的休眠細(xì)菌，以及僅在生物膜中特異性表達(dá)的抗性基因。這些產(chǎn)生抗生素耐藥性的細(xì)菌特性推動(dòng)了有效殺死細(xì)菌生物膜的新型策略的需求。
植物精油已經(jīng)被用作天然藥物，對抗多種病原體，包括細(xì)菌、真菌和病毒已有數(shù)百年歷史。幾種精油通過破壞細(xì)胞壁和膜，導(dǎo)致細(xì)胞破裂、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏和質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力抑制而表現(xiàn)出抗菌活性。此外，有證據(jù)表明它們能有效殺死細(xì)菌而不促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生。最后，許多精油相對容易獲得，哺乳動(dòng)物毒性低，并且在水和土壤中快速降解，因此相對環(huán)保。
在這里，我們研究了所選精油殺死由銅綠假單胞菌(PAO1),假單胞菌(KT2440),和金黃色葡萄球菌SC-01形成的生物膜的能力。銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，存在于土壤、水和動(dòng)物中，但在人體內(nèi)也是機(jī)會性病原體。它可感染肺部和尿路、傷口和燒傷，并通過在導(dǎo)尿管等醫(yī)療設(shè)備上形成生物膜而導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)療并發(fā)癥。由銅綠假單胞菌形成的生物膜使這種病原體能夠逃避抗生素治療并引起持久的、有時(shí)是致命的感染。其密切相關(guān)的物種假單胞菌也可以形成生物膜，但不是病原體。通常，P.putida會在環(huán)境中找到，尤其是在土壤、淡水和植物根部。革蘭氏陽性菌種S.aureus可以作為共生體和病原體存在。作為病原體，這種細(xì)菌會導(dǎo)致廣泛的疾病，從表淺皮膚感染到嚴(yán)重的全身性感染。S.aureus的治療因抗生素耐藥性而變得復(fù)雜，這在多藥耐藥株如耐甲氧西林S.aureus(MRSA)中尤其成問題。
植物Cinnamomum樹皮的提取物對多種微生物具有抗菌活性，包括P.aeruginosa。在之前的研究所中，Cinnamomum提取物對P.aeruginosa的影響是在溶液中對單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行測試的。在這里，我們想知道這種強(qiáng)效的抗菌劑是否也對這種細(xì)菌在生物膜中的效果。
為了解決這個(gè)問題，銅綠假單胞菌生物膜在顯微鏡載玻片的氣液界面上生長，載玻片半浸在含有PAO1的穆勒-希頓肉湯（MHB）中，其在600納米波長下的光密度（OD600）為0.0025。在室溫下培養(yǎng)24小時(shí)后，用H2O洗滌生物膜，然后用陽離子調(diào)整的MHB挑戰(zhàn)，其中含有0.2%或0.1%（體積/體積）的肉桂油（Cinnamomum aromaticum，100%純度；Aura Cacia）或3μg ml?1粘菌多粘菌素。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，使用修改后的CLSI肉湯微稀釋法，帶有2小時(shí)挑戰(zhàn)期，0.2%（體積/體積）肉桂油和3μg/ml粘菌多粘菌素被確定為這些化學(xué)物質(zhì)在溶液中徹底消滅銅綠假單胞菌所需的最低濃度（表1）。在肉桂油的情況下，添加0.1%（體積/體積）吐溫80混合油與培養(yǎng)基。在此濃度下，吐溫80不會影響游離細(xì)胞或生物膜中細(xì)胞的生長或活力（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)過2小時(shí)后，處理過的生物膜用H2用LIVE/DEAD BacLight（Invitrogen）染色，并通過廣域熒光顯微鏡成像。BacLight使用兩種核酸染料的組合：SYTO9，一種膜通透的綠色染料，可標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞，和碘化丙啶，一種膜不透的紅色染料，僅標(biāo)記膜受損的細(xì)胞并消除綠色SYTO9信號。懸浮細(xì)胞（最終OD600=0.25）用與生物膜相同的濃度的肉桂油或粘菌多粘菌素處理2小時(shí)，然后放入玻璃底96孔板進(jìn)行成像。
表1品種最小抑制濃度（MICs）從肉湯微稀釋法注
一個(gè)多粘菌素和精油的最低抑制濃度（MIC）通過標(biāo)準(zhǔn)肉湯微稀釋法測定。數(shù)據(jù)為平均值；每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。測試的每種精油的最高濃度為5%（體積/體積）。未在測試范圍內(nèi)顯示出抗菌活性的精油的MIC值列為“>5%”。除非三次試驗(yàn)的結(jié)果完全相同，否則報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)誤差。
我們的結(jié)果表明，消除游離細(xì)胞所需的粘菌多粘菌素的最小抑制濃度（3μg ml?1）對生物膜內(nèi)的細(xì)胞無效，因?yàn)楹艽笠徊糠旨?xì)胞仍然被染成綠色（圖1，右上角）。相比之下，肉桂油對游離細(xì)胞的最小抑制濃度（0.2%）（表1）也足以殺死生物膜內(nèi)大多數(shù)銅綠假單胞菌細(xì)胞（圖1，中間），這表明這些細(xì)胞沒有受到肉桂油的保護(hù)。稍微低一點(diǎn)的精油濃度（0.1%）沒有殺死溶液中的細(xì)菌或生物膜中的細(xì)菌（圖1，底部）。
圖1大豆油與粘細(xì)菌和生物膜具有相似的殺傷效率。細(xì)胞暴露于粘菌素或大豆油中2小時(shí)，然后用活死染色劑染色以確定細(xì)胞活力。活細(xì)胞用綠色（SYT09）標(biāo)記，死細(xì)胞用紅色（碘化丙啶）標(biāo)記。
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