不同保存條件、培養(yǎng)基對(duì)淋病奈瑟菌存活率的影響——結(jié)果、討論
二、結(jié)果
1.7種淋球菌選擇性培養(yǎng)基的初步評(píng)估：1號(hào)淋球菌在自制培養(yǎng)基及7種商品化培養(yǎng)基上均能密集生長(zhǎng)；2號(hào)淋球菌在7種商品化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)均不如自制培養(yǎng)基；自制培養(yǎng)基及巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板、一次性GC瓊脂培養(yǎng)基及淋球菌瓊脂平板均能完全抑制黏液奈瑟菌的生長(zhǎng)；自制培養(yǎng)基對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)的抑制效果較差，淋球菌（T-M）選擇培養(yǎng)基能完全抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)；混合菌在自制培養(yǎng)基及淋球菌分離培養(yǎng)板、淋球菌（T-M）選擇培養(yǎng)基、巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板及一次性GC瓊脂培養(yǎng)基等培養(yǎng)基上分離效果較好，呈現(xiàn)淋球菌菌落大、雜菌小或無(wú)雜菌。5株淋球菌質(zhì)控菌株在7種商品化的淋球菌選擇性培養(yǎng)基與自制淋球菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的結(jié)果見表1。
| 培養(yǎng)基 | 1號(hào)淋球菌 | 2號(hào)淋球菌 | 黏液奈瑟菌 | 糞腸球菌 | 混合菌* |
|---|---|---|---|---|---|
| 自制淋球菌選擇性培養(yǎng)基 | 菌落較大,無(wú)色半透明,1區(qū)++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 菌落較大,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | - | 灰白色,++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 |
| 淋球菌分離培養(yǎng)板 | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)++,2區(qū)分出單個(gè)菌落 | + | 較透明,++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 |
| 淋球菌(T-M)選擇培養(yǎng)基 | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++,2區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++ ~ +++ | - | 純淋球菌,無(wú)雜菌 |
| 巧克力平板(淋球菌) | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++,2區(qū)分出單個(gè)菌落 | - | ++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 |
| 淋球菌選擇培養(yǎng)基 | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++,2區(qū)分出單個(gè)菌落,3區(qū)2個(gè)菌落 | ++ | ++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 淋球菌小,雜菌大,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 |
| MTM瓊脂平板 | 菌落較大,灰白色,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 | - | ++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落,有溶血環(huán) | 2區(qū)分出單個(gè)淋球菌,3區(qū)無(wú)淋球菌,只有雜菌 |
| 一次性GC瓊脂培養(yǎng)基 | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 | - | ++++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 |
| 淋球菌瓊脂平板 | 菌落較小,無(wú)色半透明,1區(qū)+++,3區(qū)分出單個(gè)菌落 | ++,2、3區(qū)分出單個(gè)菌落 | - | ++ | 菌落較小,1區(qū)3個(gè)雜菌,2、3區(qū)無(wú)雜菌 |
| 注:生長(zhǎng)情況,“+”:1~10個(gè)菌落(稀疏生長(zhǎng));“++”:11~100個(gè)菌落(中等生長(zhǎng));“+++”:>100個(gè)菌落,但未融合(密集生長(zhǎng));“++++”:菌落融合成片(無(wú)法計(jì)數(shù));-:無(wú)菌生長(zhǎng)。“混合菌,含1株淋球菌(編號(hào)ATCC49226)和1株糞腸球菌(編號(hào)ATCC29212) | |||||
2.CO?依賴型淋球菌的篩選：在CO?環(huán)境下，16株淋球菌均呈現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)（菌落融合成片）。無(wú)CO?條件下，11株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，表現(xiàn)為菌落數(shù)量顯著減少或無(wú)菌落生長(zhǎng)；5株（ATCC49226、WHOG、NJ08-94、NJ08-112、NJ08-118）在無(wú)CO?環(huán)境下仍有一定數(shù)量的菌落，但數(shù)量明顯少于有CO?環(huán)境下的生長(zhǎng)結(jié)果。
3.4種保存液保存淋球菌的效果觀察：淋球菌在4種保存液中-70℃保存1周至12個(gè)月，培養(yǎng)菌落均融合成片，保存效果未見差異。在-20℃條件下，不同保存液的性能可存明顯，30%甘油胰酶大豆肉湯保存效果最好，3個(gè)月時(shí)可存活，6個(gè)月時(shí)仍有少數(shù)存活；其次為20%甘油腦心浸液，3個(gè)月時(shí)可存活；10%甘油小牛血清保存1個(gè)月時(shí)僅部分存活；10%二甲基亞砜小牛血清保存效果最差，2周時(shí)僅部分存活。
4.淋球菌不同保存方法的效果：未凍干的淋球菌在4℃、-18℃、-29℃、-70℃和液氮下的保存時(shí)間存在差異，4℃保存4 d即無(wú)淋球菌存活；-18、-29℃下，1個(gè)月時(shí)僅分別見10、12個(gè)菌落；在-70℃和液氮中保存6個(gè)月仍可存活（菌落融合成片）。凍干后的淋球菌在4℃、-18℃、-29℃、-70℃保存6個(gè)月仍可存活（菌落融合成片），25℃可保存1個(gè)月，37℃可保存3 d（菌落融合成片）。
三、討論
目前淋球菌的檢測(cè)方法主要有直接鏡檢法、分離培養(yǎng)法和核酸擴(kuò)增檢測(cè)法等，分離培養(yǎng)法仍是淋球菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，且可同時(shí)進(jìn)行淋球菌耐藥實(shí)驗(yàn)。高質(zhì)量的淋球菌選擇性培養(yǎng)基是臨床獲得分離淋球菌成功的至關(guān)重要因素之一。目前常用的淋球菌培養(yǎng)基通過(guò)添加抗生素抑制雜菌的生長(zhǎng)，但部分種類的抗生素（如萬(wàn)古霉素）對(duì)淋球菌生長(zhǎng)也有影響。本研究中淋球菌在7種商品化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)存在差異，不排除其他抗生素引起的淋球菌生長(zhǎng)受到抑制。
混合菌主要用于驗(yàn)證淋球菌選擇性培養(yǎng)基對(duì)雜菌的抑制能力以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員對(duì)淋球菌的分離鑒定能力。不同種類淋球菌選擇性培養(yǎng)基對(duì)雜菌的抑制能力各不相同，直接干擾實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員對(duì)淋球菌的分離鑒定水平[4]。此外，隨著淋球菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，對(duì)淋球菌培養(yǎng)基的配方提出了更高的要求，商品化的淋球菌培養(yǎng)基質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。
燭缸培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)方法，尤其適用于資源受限的偏遠(yuǎn)及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)[5]。無(wú)論淋球菌參考菌株還是臨床分離株，都需依賴一定量的CO?環(huán)境才能生長(zhǎng)，只有極少數(shù)淋球菌在培養(yǎng)時(shí)不依賴CO?的環(huán)境[3]。因此，在開展淋球菌培養(yǎng)時(shí)，需確保培養(yǎng)成本放入燭缸后的密閉性，以免影響淋球菌的培養(yǎng)結(jié)果，造成假陰性。
淋球菌是一種苛養(yǎng)菌，其營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)和保存較難。對(duì)于淋球菌的長(zhǎng)期保存，建議使用-70℃條件下的任何一種保存液，尤其是20%甘油腦心浸液，其在-20℃下也有較好的保存效果。對(duì)于基層醫(yī)療單位在實(shí)驗(yàn)室條件有限的情況下，30%甘油胰酶大豆肉湯是比較實(shí)用的保存方法。本次研究只對(duì)淋球菌少量參考菌株和臨床分離株進(jìn)行了保存效果觀察，對(duì)于淋球菌大樣本的保存效果仍需要進(jìn)一步研究。
菌種保存方法有多種，如固體培養(yǎng)基保存法、半固體穿刺保存法、干燥保存法及超低溫保存等[6]。理想的菌種保存不僅要維持菌株的活性，還需確保菌株固有的生物學(xué)性狀及抗原特性。淋球菌對(duì)外界理化因子的抵抗力較弱，對(duì)熱敏感，易產(chǎn)生自溶酶。常規(guī)的固體培養(yǎng)基需定期傳代，操作較為煩瑣并易導(dǎo)致菌株突變[7]，目前冷凍干燥法是淋球菌保存運(yùn)輸?shù)淖罴逊椒?。?duì)于未凍干菌株，-70℃或液氮是更優(yōu)的選擇；而凍干菌株在多種低溫條件下均能較好保存。本研究顯示淋球菌凍干后保存要優(yōu)于未凍干狀態(tài)保存。
綜上所述，本研究主要比較淋球菌商品化培養(yǎng)基與自制培養(yǎng)基的性能、篩選CO?依賴型菌株、評(píng)估4種自制保存液對(duì)淋球菌的保存效果以及淋球菌在凍干前后的存活情況。結(jié)果表明，淋球菌的分離培養(yǎng)在自制培養(yǎng)基及一定量的CO?環(huán)境下能較好生長(zhǎng)，30%甘油腦心浸液保存淋球菌的效果要優(yōu)于其他保存液，超低溫及凍干后保存可以提高其存活時(shí)間。本次評(píng)估僅局限于本實(shí)驗(yàn)室，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，未來(lái)在研究開展前應(yīng)進(jìn)行重復(fù)性設(shè)計(jì)并做預(yù)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)熟練掌握操作流程、遵循安全規(guī)范、及時(shí)詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)等，有條件可以開展多中心評(píng)估。
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