基于生長速率法優(yōu)化放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件（三）
2.5放線菌R2A-77菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化
2.5.1 pH
指狀青霉生長圈隨發(fā)酵初始pH的增大呈先緩慢減小后增大的趨勢。pH為7.0時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為10.27 mm；發(fā)酵初始pH低于7.0時，菌圈呈現(xiàn)出逐步擴張的態(tài)勢；而隨著pH不斷增大，指狀青霉的生長圈隨之增大。說明放線菌R2A-77菌株在強酸或強堿條件下，并不適宜產(chǎn)生具有活性的物質(zhì)。因此，確定pH為7.0作為放線菌R2A-77菌株發(fā)酵的最優(yōu)初始pH。
2.5.2發(fā)酵時間
指狀青霉生長圈隨發(fā)酵時間的延長呈先下降后上升的趨勢。發(fā)酵至第6天時指狀青霉生長圈最小，生長圈平均直徑為10.85 mm。故發(fā)酵時間選用6 d作為放線菌R2A-77菌株的最優(yōu)發(fā)酵時間。
2.5.3接種量
指狀青霉生長圈隨放線菌R2A-77接種量的增加呈先降后升的趨勢。當(dāng)接種量為3%時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為10.75 mm；其他接種量均導(dǎo)致放線菌R2A-77菌株的抑菌活性下降。在接種量逐漸增加的初期階段，放線菌R2A-77菌株產(chǎn)生的代謝物含量隨之上升，使得抑菌活性逐漸增強；接種量大于3%，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)難以滿足過量細胞的需求，細胞活性成分的合成過程受到限制，最終導(dǎo)致抑菌活性降低。因此，確定3%作為放線菌R2A-77菌株的最優(yōu)接種量。
2.5.4裝液量
指狀青霉的生長圈隨裝液量的增加呈先降后升的趨勢。當(dāng)250 mL錐形瓶的裝液量為150 mL時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為9.83 mm；在裝液量逐漸增加的初始階段，由于錐形瓶內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)隨之增多，為放線菌R2A-77菌株提供了更豐富的原料，使其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力增強，然而，隨著裝液量的進一步增加，錐形瓶內(nèi)的氣體空間被壓縮，氧氣含量逐漸減少難以滿足放線菌R2A-77有氧呼吸的需求，當(dāng)氧氣不足時，放線菌R2A-77的生長與代謝活動受到抑制，進而影響其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力。因此，確定放線菌R2A-77菌株的最優(yōu)裝液量為150 mL/250 mL。
2.6驗證試驗
綜合以上優(yōu)化結(jié)果，以10 g/L蔗糖、35 g/L大豆蛋白胨、1000 mL蒸餾水的改良MS發(fā)酵培養(yǎng)基，以發(fā)酵初始pH為7.0，接種量為3%，裝液量為150 mL/250 mL，發(fā)酵6 d，對發(fā)酵液的抑菌活性進行測定，結(jié)果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵液抑菌率為98%，優(yōu)化前的抑菌率為83%。
3討論
放線菌是一個豐富的微生物類群，已鑒定出至少有180個屬2000多個種。而放線菌合成抗生素物質(zhì)是人們關(guān)注的焦點之一，據(jù)研究統(tǒng)計，70%的抗生素來自放線菌，50%來自鏈霉菌。除了產(chǎn)生抗生素外，放線菌發(fā)酵產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)病蟲害防治及醫(yī)學(xué)抗真菌藥物研制方面也是重要材料。國內(nèi)外學(xué)者通過對多種鏈霉菌進行了深入研究。例如，王寧等通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rRNA序列分析等手段成功鑒定出蘋果樹腐爛病生防菌株A144為婁徹氏鏈霉菌；蔣冬陽等篩選到對引起大豆根腐病的多種病原菌以及大豆白絹病菌、草莓灰霉病菌、稻瘟病菌等均有很好抑制作用的弗吉尼亞鏈霉菌IRHB 47；HAMED等從海洋沉積物中分離到1株對白色念珠菌ATCC 10231具有極強拮抗活性的放線菌菌株MK388207，經(jīng)鑒定，該菌株為鏈霉菌屬。而較少有關(guān)鏈霉菌防治指狀青霉的研究報道。本研究從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離的放線菌R2A-77屬鏈霉菌，對指狀青霉具有良好的抑制作用。
已有研究表明，優(yōu)化活性菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可提升抑菌活性物質(zhì)的作用。劉一賢等通過研究表明，發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌17-7菌株的最適合碳源為玉米粉10 g/L和葡萄糖10 g/L，最適氮源為大豆粉25 g/L和酵母粉2 g/L。劉芳等優(yōu)化的鏈霉菌SZF-179最適發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為麥芽糖15.86 g/L和土豆淀粉10.00 g/L，氮源為酵母膏8.15 g/L。由此可知，不同的鏈霉菌在發(fā)酵中會受碳源、氮源的種類及其濃度的影響。此外，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵裝液量和接種量能促進發(fā)酵活性物質(zhì)的產(chǎn)生。例如，對多種植物真菌具有拮抗作用的鏈霉菌FIM-B0711的最佳發(fā)酵條件：pH為7.0，接種量為3%，裝液量為30 mL/250 mL，發(fā)酵時間為96 h，在該發(fā)酵條件下發(fā)酵物產(chǎn)量提升了57.69%。高加索鏈霉菌（S.ciscaucasicus）SS9-1的最佳發(fā)酵條件：裝液量為150 mL，接種量為3%，pH為8.0，發(fā)酵時間為7 d，在該發(fā)酵條件下發(fā)酵物對番茄灰霉病的拮抗效果提高到98.43%。因此不同的鏈霉菌有不同的營養(yǎng)要求和發(fā)酵條件。本研究對放線菌R2A-77菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件進行優(yōu)化。通過優(yōu)化，該菌株的抑菌率提升15%，抑菌率達到98%。
本研究的放線菌R2A-77與前期研究的放線菌R2A-15同屬于鏈霉菌，但是16S rRNA基因序列不同，通過在NCBI上進行blastn比對，發(fā)現(xiàn)2株菌的16S rRNA基因序列相似性僅為95.29%。在進化關(guān)系上，與放線菌R2A-77最相似菌株為S.salinarius SS06011，與放線菌R2A-15最相似菌株為S.virginiae NRRL ISP-5094。放線菌R2A-15在MS培養(yǎng)基上形成的菌落較大，氣生菌絲呈粉色，基內(nèi)菌絲呈米黃色，表型特征明顯與放線菌R2A-77不同。
本研究采用生長速率法測定放線菌R2A-77發(fā)酵液對靶標菌的抑菌活性，篩選獲得的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基僅含蔗糖、大豆蛋白胨和蒸餾水，而放線菌R2A-15的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基包含玉米面、酸水解酪蛋白、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉和蒸餾水，表明放線菌R2A-77的發(fā)酵培養(yǎng)基原料種類更簡單、成本更低廉。但在發(fā)酵條件上放線菌R2A-15的發(fā)酵時間僅需37.54 h，搖瓶裝液量減少至100 mL/250 mL，因此其發(fā)酵效率更高。研究表明，放線菌R2A-15和放線菌R2A-77對指狀青霉均有較高的抑菌活性，因此，這2株放線菌均具有重要的研究價值和應(yīng)用潛力。后續(xù)研究重點將聚焦于其發(fā)酵活性物質(zhì)的分離與鑒定。
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