基于生長(zhǎng)速率法優(yōu)化放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件（一）
摘要
柑橘是我國(guó)優(yōu)勢(shì)水果產(chǎn)業(yè)，對(duì)推動(dòng)鄉(xiāng)村振興具有重要意義。但柑橘表面存在許多自然孔口，在采后貯藏和運(yùn)輸過程中極易受到病原菌的侵染而發(fā)生病害。其中，柑橘綠霉病是由指狀青霉（Penicillium digitatum）侵染而成，發(fā)病過程快，傳染性強(qiáng)，造成果實(shí)采收后品質(zhì)嚴(yán)重下降，給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本團(tuán)隊(duì)以柑橘綠霉病病原菌為靶標(biāo)菌，從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離篩選出1株對(duì)柑橘綠霉病病原菌具有良好拮抗作用的放線菌R2A-77，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，采用生長(zhǎng)速率法對(duì)靶標(biāo)菌生長(zhǎng)圈直徑判斷發(fā)酵液的抑菌活性，采用單因素和交叉組合試驗(yàn)優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，以提高發(fā)酵液抑菌活性。
結(jié)果表明：放線菌R2A-77初步鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）；最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨35 g/L、蒸餾水1000 mL；最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵初始pH 7.0、發(fā)酵時(shí)間為6 d、接種量為3%、裝液量為150 mL/250 mL；放線菌R2A-77發(fā)酵條件優(yōu)化后，其發(fā)酵液的抑菌活性比優(yōu)化前提高15%，抑菌率為98%。結(jié)果說明，放線菌R2A-77對(duì)指狀青霉具有較好的拮抗效果，有較好的實(shí)際應(yīng)用前景，該研究結(jié)果為綠色防控柑橘綠霉病積累了資源，為后期規(guī)模化發(fā)酵以及生防菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
放線菌是一類極具開發(fā)潛力的生物資源，在空氣、土壤以及水體中均可生存，且具有生長(zhǎng)速度快和代謝產(chǎn)物多等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。目前，利用生防放線菌與病原菌的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系或拮抗作用來控制病害已成為研究熱點(diǎn)。已有研究表明，放線菌發(fā)酵液對(duì)辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、山茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）等植物病原菌具有良好的抑菌活性。在公眾對(duì)食品安全關(guān)注度持續(xù)攀升的當(dāng)下，利用生物手段防治農(nóng)作物病害，已成為農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域的關(guān)鍵研究課題。
指狀青霉（Penicillium digitatum）是一種壞死營(yíng)養(yǎng)型的病原真菌，可通過果實(shí)表面的損傷入侵果實(shí)內(nèi)部組織，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，進(jìn)而利用營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)。柑橘在田間生長(zhǎng)、采收及貯藏運(yùn)輸過程中極易受到物理?yè)p傷而產(chǎn)生傷口，這為病原微生物的入侵創(chuàng)造了條件，最終導(dǎo)致果實(shí)腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)水果病害的防治主要依賴化學(xué)殺菌劑，但長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性而降低防治效果，還會(huì)嚴(yán)重危害人體健康和環(huán)境。而生物防治法采用具有安全性、有效性、環(huán)保性和高經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)勢(shì)的拮抗微生物，可實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)。NAJMEH等從農(nóng)田土壤中分離出的110株鏈霉菌菌株對(duì)指狀青霉具有良好的抑制作用。林書華等揭示了鏈霉菌X33發(fā)酵提取物（SLFE）對(duì)柑橘綠霉病菌具有防治效果。本團(tuán)隊(duì)從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤中分離篩選出1株對(duì)指狀青霉具有較好拮抗活性的放線菌R2A-77，本研究對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定以及發(fā)酵條件優(yōu)化，為廉江紅橙土壤微生物資源及活性物質(zhì)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株和病原真菌
從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤分離篩選出放線菌R2A-77。指狀青霉由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院曾凱芳教授惠贈(zèng)。
1.1.2培養(yǎng)基
菌株鑒定固體培養(yǎng)基：ISP系列培養(yǎng)基（ISP1~ISP7）、PDA培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、改良G2培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、黑色素培養(yǎng)基、硫化氫培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基。
菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP系列培養(yǎng)基（ISP1~ISP7）、PDA培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、改良G2培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基：改良G2培養(yǎng)基。
1.2方法
1.2.1菌株鑒定
（1）形態(tài)學(xué)觀察。將菌株劃線接種至ISP3固體培養(yǎng)基，28℃條件培養(yǎng)5 d，用掃描電鏡觀察菌絲特征及孢子形態(tài)。
采用固體培養(yǎng)基劃線接種菌株，在28℃下培養(yǎng)10 d。在第3、5、7、10天采用平皿插片法和光學(xué)顯微鏡觀察菌株菌體形態(tài)，篩選出菌株最優(yōu)生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
（2）生理生化特征測(cè)定。參考文獻(xiàn)中的方法對(duì)菌株的生理生化特性進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定內(nèi)容包括：最適溫度、最適鹽濃度、最適培育pH、過氧化氫酶的產(chǎn)生、黑色素/硫化氫的產(chǎn)生、明膠液化、牛奶凝固或胨化。
（3）16S rRNA基因序列測(cè)定與分析。將菌株送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選相似菌株。采用MEGA 11軟件進(jìn)行鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育分析，設(shè)置1000次bootstrap評(píng)估拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，構(gòu)建16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。
1.2.2菌株抑菌能力測(cè)定
（1）菌種活化和制備種子液。菌種活化：將菌種接種至改良G2固體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)5 d。
制備種子液：將菌株接種至150 mL/250 mL的改良G2液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d。
（2）制備菌株無菌發(fā)酵液。將3%的種子液加入到150 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min培養(yǎng)5 d。取發(fā)酵上清液，于10 000 r/min離心15 min，用0.22μm微孔濾膜過濾后得到無菌發(fā)酵濾液。
（3）發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定菌株發(fā)酵液對(duì)靶標(biāo)菌的抑菌活性。發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1∶10（V/V）制成平板。將8 mm靶標(biāo)菌菌餅置于平板中央，于28℃培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算平均值和抑菌率。抑菌率=[(對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑)/(對(duì)照病原菌菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。
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