小龍蝦貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌篩選、及微生物菌群結(jié)構(gòu)分析（二）
1.3.3腐敗菌單菌落的分離及純化
將鮮活小龍蝦碎冰猝死后，置于4℃條件下貯藏，選擇貯藏腐敗終點(diǎn)的小龍蝦樣品按照1.3.1節(jié)中的方法制成菌懸液，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x擇合適稀釋倍數(shù)菌液均勻涂布于NA、CFC培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基、RYAN培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h，在選擇性培養(yǎng)基上挑選不同顏色、形態(tài)的菌落，挑取單菌落并進(jìn)行2～3次劃線純化，并于-80℃保存。
1.3.4腐敗菌菌種的鑒定
1.3.4.1分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建
腐敗菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中孵育至對(duì)數(shù)穩(wěn)定期，提取細(xì)菌DNA并進(jìn)行16S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，最終產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）與Gen Bank庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)。選取相似性在98%以上的菌株序列，利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.3.4.2生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定
根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等，應(yīng)用一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，將篩選得到的腐敗菌菌種作進(jìn)一步鑒定。
1.3.5高通量測(cè)序法測(cè)定小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌
選取在4℃貯藏0 d（鮮樣期）、8 d（腐敗初期）、12 d（腐敗中期）、16 d（腐敗末期）的小龍蝦，取蝦肉進(jìn)行制樣，得到菌懸液。提取樣品菌懸液的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將檢測(cè)合格后的DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。
1.4數(shù)據(jù)處理
每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，采用Origin 7.5軟件作圖。
2結(jié)果與分析
2.1小龍蝦4℃貯藏期間菌落總數(shù)及TVB-N含量變化
圖1 4℃貯藏期間小龍蝦菌落總數(shù)的變化
小寫(xiě)字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。下同。
水產(chǎn)品及肉類(lèi)食物容易在微生物及酶的作用下發(fā)生蛋白質(zhì)分解、脂質(zhì)氧化等生化反應(yīng)，進(jìn)而引起腐敗變質(zhì)。因此可以通過(guò)測(cè)定小龍蝦肉中的菌落總數(shù)來(lái)初步判斷小龍蝦被細(xì)菌污染及腐敗的程度，反映蝦的品質(zhì)。由圖1可知，小龍蝦在4℃貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，貯藏0～2 d，其增長(zhǎng)趨勢(shì)比較緩慢，說(shuō)明小龍蝦并沒(méi)有發(fā)生明顯的腐敗。而貯藏2～10 d，菌落總數(shù)急劇增加，說(shuō)明小龍蝦在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重腐敗。貯藏6 d左右，小龍蝦菌落總數(shù)超過(guò)無(wú)公害水產(chǎn)品安全限值（6.0（lg（CFU/g））），表明此時(shí)小龍蝦腐敗嚴(yán)重，到達(dá)了其貨架期的終點(diǎn)。江楊陽(yáng)等對(duì)江蘇盱眙產(chǎn)地小龍蝦研究發(fā)現(xiàn)，菌落總數(shù)也在6 d超過(guò)6.0（lg（CFU/g））。除此之外，Li Yan等發(fā)現(xiàn)，南美白對(duì)蝦同樣在貯藏6 d菌落總數(shù)超過(guò)了限值。本實(shí)驗(yàn)中的小龍蝦在貯藏10 d之后，菌落總數(shù)不再明顯增長(zhǎng)，逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。
圖2 4℃貯藏期間小龍蝦TVB-N含量的變化
TVB-N是在微生物和酶的雙重作用下分解蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)產(chǎn)生的生物胺、氨等揮發(fā)性堿性代謝物質(zhì)的總稱(chēng)，其含量是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品及肉類(lèi)品質(zhì)最重要的指標(biāo)，是判斷水產(chǎn)品新鮮程度及是否腐敗變質(zhì)的重要因素。由圖2可知，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，TVB-N含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，前期增長(zhǎng)比較緩慢，在貯藏后期隨著菌落總數(shù)的快速增長(zhǎng)、腐敗加劇，導(dǎo)致了TVB-N含量增加速率加快。小龍蝦TVB-N含量在貯藏6 d時(shí)已達(dá)43.28 mg/100 g，與秦求思等測(cè)得的4℃貯藏6 d的鷹爪蝦TVB-N含量相近，超過(guò)GB 10136—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性水產(chǎn)制品》中所規(guī)定的淡水水產(chǎn)品TVB-N含量限定值30 mg/100 g，并且伴隨強(qiáng)烈的動(dòng)物腐爛的氨臭味。這與小龍蝦菌落總數(shù)超過(guò)限值的貯藏時(shí)間相一致，表明TVB-N含量變化與菌落總數(shù)密切相關(guān)，結(jié)合2個(gè)指標(biāo)結(jié)果綜合分析得出，小龍蝦在貯藏6 d時(shí)已經(jīng)腐敗。
2.2優(yōu)勢(shì)腐敗菌單菌落的分離
選擇在4℃貯藏至腐敗的小龍蝦進(jìn)行平板涂布、劃線，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色差異在5種固體培養(yǎng)基上分離純化出10株細(xì)菌，編號(hào)依次為B1～B10。10株細(xì)菌菌落形態(tài)及顏色具體見(jiàn)表1。
表1所篩選腐敗菌菌落的形態(tài)特征
2.3腐敗菌菌種的鑒定
2.3.1腐敗菌菌株分子生物學(xué)鑒定
對(duì)菌株B1～B10進(jìn)行16S rDNA測(cè)序后，登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，并選取Max ident在98%以上的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）及測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果，將B5、B6、B7、B9及B10細(xì)菌定種，分別為中間氣單胞菌（Aeromonas media）、巨型球菌（Macrococcus caseolyticus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）及缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）。
圖3基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
2.3.2生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定
根據(jù)測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)已對(duì)部分菌株定種，對(duì)仍無(wú)法定種的幾種腐敗菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，最終確定菌株B1～B4及B8的種類(lèi)，分別為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。
表2部分菌株生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：-.陰性；+.陽(yáng)性；/.未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
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