小龍蝦貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌篩選、及微生物菌群結(jié)構(gòu)分析（一）
摘要：以4℃貯藏小龍蝦貨架期終點(diǎn)篩選武漢孝感小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌，同時(shí)結(jié)合高通量測(cè)序方法，進(jìn)一步確定小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并對(duì)小龍蝦貯藏過(guò)程中菌相變化、微生物結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：傳統(tǒng)培養(yǎng)法從腐敗小龍蝦中共篩選出10株腐敗菌，包括波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）等；在屬水平上，高通量測(cè)序法最終確定氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）及希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）是小龍蝦腐敗末期相對(duì)豐度最大的2種優(yōu)勢(shì)腐敗菌；同時(shí)，高通量測(cè)序結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，小龍蝦微生物群落豐富度、多樣性及均勻度不斷下降，這與腐敗末期優(yōu)勢(shì)腐敗菌的大量增長(zhǎng)及生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中抑制其他種類微生物有關(guān)。
小龍蝦，也稱克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬于淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，19世紀(jì)30年代引入我國(guó)。因其風(fēng)味獨(dú)特、肉質(zhì)鮮美，同時(shí)具有高蛋白、低熱量的特性，受到廣大消費(fèi)者的喜愛，成為人們餐桌上常見的美食。水產(chǎn)品由于營(yíng)養(yǎng)豐富且水分含量較高而容易引起細(xì)菌的增殖進(jìn)而腐敗，難以保存。而小龍蝦好溫喜濕，常見于淤泥等復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境，因此其本身攜帶的微生物種類和數(shù)量更多。同時(shí)，小龍蝦含有大量的自由氨基酸及內(nèi)源氧化酶，因此相較于其他水產(chǎn)品而言，更容易遭到微生物的侵襲，這些都在一定程度上影響了小龍蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
大量研究發(fā)現(xiàn)，在水產(chǎn)品腐敗過(guò)程中部分種類細(xì)菌的數(shù)量逐漸上升并占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，對(duì)水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)起著主導(dǎo)作用，這些細(xì)菌被稱為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，其為水產(chǎn)品品質(zhì)下降最重要的原因。不同水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌種類會(huì)存在一些差異，于淑池等發(fā)現(xiàn)，冷藏卵形鯧鲹中優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌及假單胞菌，Leroi等在4℃冷藏生鮭魚中發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為假單胞菌，南美白對(duì)蝦中主要腐敗菌則為不動(dòng)桿菌、希瓦氏菌，而淡水水產(chǎn)品，如鰱魚和草魚中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為氣單胞菌和假單胞菌。對(duì)于水產(chǎn)品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選和鑒定，在早期的研究中一般都是利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，目前研究中廣泛利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合高通量測(cè)序法對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行篩選和鑒定。同時(shí)，高通量測(cè)序方法還可以對(duì)貯藏過(guò)程中水產(chǎn)品的微生物結(jié)構(gòu)組成及其多樣性進(jìn)行分析，目前已在帶魚、牡蠣等水產(chǎn)品中成功應(yīng)用，明確了微生物在產(chǎn)品貯藏過(guò)程中的變化趨勢(shì)。
本研究篩選和鑒定武漢孝感小龍蝦4℃貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并對(duì)小龍蝦貯藏過(guò)程中菌相變化以及微生物菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行分析。優(yōu)勢(shì)腐敗菌是水產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵控制點(diǎn)，與水產(chǎn)品貨架期密切相關(guān)，因此開展對(duì)小龍蝦中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的研究與篩選鑒定，有利于下一步利用殺菌保鮮技術(shù)靶向殺滅優(yōu)勢(shì)腐敗菌，提高保鮮效果，延長(zhǎng)小龍蝦貨架期。
1材料與方法
1.1材料與試劑
小龍蝦來(lái)源于武漢孝感，經(jīng)加冰保活運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室備用，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前加冰猝死。
氯化鈉、硼酸、氧化鎂、鹽酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、假單胞菌選擇性瓊脂（Pseudomonas CFC selective agar，CFC）培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）培養(yǎng)基、BP（Baird-Parker）培養(yǎng)基、氣單胞菌基礎(chǔ)（Aeromonas medium base，RYAN）培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
凱氏定氮儀；電子天平；TS-2402CL恒溫振蕩器；恒溫培養(yǎng)箱；GI80TW全自動(dòng)高壓滅菌器。
1.3方法
1.3.1小龍蝦貯藏期間菌落總數(shù)的測(cè)定
采用活菌平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定小龍蝦中總需氧菌菌落總數(shù)，測(cè)定方法參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。稱取10 g蝦肉，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，在無(wú)菌條件下勻漿，制成10 g/100 mL樣品均質(zhì)液。之后用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。取稀釋后的樣品100μL涂布于NA平板上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，選取合適的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，單位為lg（CFU/g）。
1.3.2小龍蝦貯藏期間總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測(cè)定
每隔2 d測(cè)定小龍蝦中TVB-N含量，測(cè)定方法參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的方法二自動(dòng)凱氏定氮儀法。準(zhǔn)確稱取2 g蝦肉糜于蒸餾管中，之后加入75 mL純水，振蕩使樣品均勻分散，并在水中浸漬30 min。測(cè)定前加入1 g MgO，將蒸餾管連接至自動(dòng)凱氏定氮儀。以20 g/L硼酸為接收液，0.01 mol/L鹽酸為滴定液，1 g/L甲基紅-乙醇溶液和1 g/L溴甲酚綠-乙醇溶液以體積比1:5混合作為混合指示劑。
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