銀杏黑斑病和輪紋病病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢試驗(yàn)和孢子萌發(fā)試驗(yàn)（一）
摘要對(duì)銀杏黑斑病菌(Alternaria tenuis Ness)和輪紋病菌(Pestalotia ginkgo Hori)進(jìn)行生長(zhǎng)、產(chǎn)孢條件和孢子萌發(fā)試驗(yàn)。結(jié)果表明，銀杏黑斑病菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢溫度為10℃~35℃，25℃生長(zhǎng)最好，35℃產(chǎn)孢最多，20℃~35℃孢子萌發(fā)良好；輪紋病菌生長(zhǎng)溫度為10℃~30℃，最適25℃，10℃下不產(chǎn)孢，20℃孢子萌發(fā)率最高。2種菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，在相對(duì)濕度(RH)65%~98%生長(zhǎng)良好，且加大RH有利于分生孢子形成，RH 100%+水滴處理孢子萌發(fā)率最高。2種菌生長(zhǎng)的pH值為2~11，偏酸性利于分生孢子萌發(fā)。葡萄糖、葉汁有促進(jìn)輪紋病菌分生孢子萌發(fā)作用；光照對(duì)黑斑病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢沒(méi)有顯著影響，但能促進(jìn)輪紋病菌孢子形成。
銀杏黑斑病和輪紋病是銀杏成株期葉片的主要病害，幾乎遍布所有的產(chǎn)區(qū)。在廣西銀杏產(chǎn)區(qū)內(nèi)，由于推廣應(yīng)用早實(shí)豐產(chǎn)技術(shù)，進(jìn)行大面積集約化栽培，銀杏品種資源進(jìn)一步單一化，這2種病的危害越來(lái)越大，嚴(yán)重地影響了銀杏果實(shí)的數(shù)量和質(zhì)量、以及銀杏葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取和系列產(chǎn)品加工。黑斑病和輪紋病常相伴發(fā)生，為了探討其發(fā)生規(guī)律，更有效地進(jìn)行防治，本文對(duì)2種病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行生長(zhǎng)、產(chǎn)孢試驗(yàn)和孢子萌發(fā)試驗(yàn)。
1 材料
1.1 供試菌株
黑斑病菌(A.tenuis)和輪紋病菌(P.ginkgo)菌株，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行分離鑒定，純化、培養(yǎng)備用。
1.2 培養(yǎng)基
PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、WA(水瓊脂培養(yǎng)基)、GLA(銀杏葉汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。將45片健康的銀杏葉，加10mL蒸餾水，于研缽中研磨，用紗布過(guò)濾，與溶化的500mL葡萄糖瓊脂液混合均勻，分裝后滅菌)。
1.3 培養(yǎng)液
1%葡萄糖液、銀杏葉汁培養(yǎng)液(將銀杏葉汁用蒸餾水稀釋)、無(wú)菌水。
2 方法
2.1 病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢試驗(yàn)
2.1.1 溫度試驗(yàn)
將2種菌株分別在PDA平板上復(fù)壯培養(yǎng)3d~4d，用滅菌的打孔器(直徑4mm)打取菌落邊緣的菌塊，移植到PDA平板上，置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每處理4次重復(fù)。
每2d測(cè)1次菌落生長(zhǎng)直徑，并記錄菌落形態(tài)、顏色變化、分生孢子開(kāi)始形成的時(shí)間等。黑斑病菌培養(yǎng)15d，從每個(gè)處理中隨機(jī)抽取一皿，用打孔器(直徑7mm)打取菌塊(鑒于黑斑病菌產(chǎn)孢量大)，用10mL蒸餾水將孢子洗下，加1~2滴Tween-80，振蕩搖勻，制成均勻的孢子懸浮液，從中取4滴于載玻片上，在20×10倍顯微鏡下鏡檢，每滴計(jì)測(cè)9個(gè)視野的孢子數(shù)，取其平均值，進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)各處理間的差異顯著性。輪紋病菌培養(yǎng)30d，從每處理中隨機(jī)抽取一皿，用10mL蒸餾水將孢子洗下，制成均勻的孢子懸浮液。檢測(cè)和分析方法同黑斑病菌。
2.1.2 濕度試驗(yàn)
菌塊按2.1.1移植方法，置于用不同濃度的H?SO?控制不同濕度的密閉容器中培養(yǎng)，設(shè)4個(gè)處理：RH 65%、RH 75%、RH 85%、RH 98%，每處理4次重復(fù)，培養(yǎng)溫度25℃。觀(guān)測(cè)方法和記錄項(xiàng)目同2.1.1。
2.1.3 培養(yǎng)基試驗(yàn)
用接種環(huán)輕取復(fù)壯好的菌絲，移植到PDA、WA、GLA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每處理4次重復(fù)，培養(yǎng)溫度25℃。觀(guān)測(cè)方法和記錄項(xiàng)目同2.1.1。
2.1.4 酸堿度試驗(yàn)
用1M HCl和1M NaOH將PDA培養(yǎng)基調(diào)配成6個(gè)不同pH值：2、4、5、7、9、11，按2.1.1方法移植接種，每處理4次重復(fù)，于25℃條件下培養(yǎng)。觀(guān)測(cè)方法和記錄項(xiàng)目同2.1.1。
2.1.5 光照試驗(yàn)
菌塊移植方法同2.1.1，先置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)4d~5d，然后分別進(jìn)行完全黑暗(用黑色塑料袋套住)、自然光照射、日光燈照射共3個(gè)處理，每處理4次重復(fù)。觀(guān)測(cè)方法和記錄項(xiàng)目同2.1.1。
2.2 孢子萌發(fā)試驗(yàn)
2種菌分別在PDA培養(yǎng)基上復(fù)壯培養(yǎng)約1個(gè)月，分別用10mL無(wú)菌水將孢子洗下，加1~2滴Tween-80，搖勻，稀釋制成均勻的分生孢子懸浮液，濃度是在10×10倍顯微鏡下每視野約80個(gè)孢子。
| 溫度 Temperature (℃) | 黑斑病菌(A.tenuis) | 輪紋病菌(P.ginkgo) | ||||||||||
| 生長(zhǎng)速度 Growth velocity (mm/d) | aa05 | αa01 | 產(chǎn)孢量 Conidial production (個(gè)/視野) | 00.05 | α0.01 | 生長(zhǎng)速度 Growth velocity (mm/d) | aa05 | aa01 | 產(chǎn)孢量 Conidial production (個(gè)視野) | α0.05 | αa01 | |
| 10 | 2.60 | d | D | 8.4 | d | C | 3.15 | e | E | 0 | c | C |
| 15 | 4.15 | c | C | 11.0 | bc | B | 4.84 | d | D | 23.0 | b | B |
| 20 | 5.03 | b | B | 5.8 | e | D | 5.47 | b | B | 48.4 | a | A |
| 25 | 5.66 | a | A | 120 | b | B | 7.88 | a | A | 44.0 | a | A |
| 30 | 4.70 | b | BC | 10.6 | c | B | 5.15 | c | C | 22.7 | b | B |
| 35 | 2.78 | d | D | 25.1 | a | A | 0 | f | F | 0 | c | C |
表1不同溫度對(duì)黑斑病菌和輪紋病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響
2.2.1 溫度試驗(yàn)
用吸管吸取孢子懸浮液，滴于載玻片上，加蓋玻片，置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫箱中保濕培養(yǎng)，每處理4次重復(fù)，分別于8h、24h進(jìn)行鏡檢，每處理計(jì)測(cè)500個(gè)以上分生孢子的發(fā)芽率，取其平均值，進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)各處理間的差異顯著性。
2.2.2 濕度試驗(yàn)
設(shè)4個(gè)處理：泡水(在培養(yǎng)皿中加5mm深的分生孢子懸浮液)，以及將分生孢子懸浮液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于用濃H?SO?控制不同相對(duì)濕度RH 90%、RH 100%、RH 100%+水滴的干燥器中培養(yǎng)，經(jīng)8h、24h鏡檢孢子的發(fā)芽情況，每處理4次重復(fù)，培養(yǎng)溫度為25℃。
2.2.3 酸堿度試驗(yàn)
用1M HCl和1M NaOH將分生孢子懸浮液調(diào)配成2、4、5、7、9、11共6個(gè)不同的pH值，用吸管分別吸取，滴于載玻片上，置于25℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)，每處理4次重復(fù)。
2.2.4 培養(yǎng)液試驗(yàn)
分別用無(wú)菌水、1%葡萄糖液、銀杏葉汁培養(yǎng)液配制成3種分生孢子懸浮液，并將濃度調(diào)至在10×10倍顯微鏡下每視野約80個(gè)分生孢子，滴于載玻片上，于25℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)。
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