梅花鹿體細胞航天誘變、細胞樣品回收培養(yǎng)技術(shù)、生長曲線及核型特性（三）
2結(jié)果與分析
2.1航天誘變梅花鹿體細胞的回收與體外培養(yǎng)
由于航天誘變條件下的動物體細胞培養(yǎng)還沒有成熟的方法，本次實驗采用自主研發(fā)的PVDF膜培養(yǎng)法，梅花鹿體細胞樣品在太空飛行12 d后成功回收建系。其細胞經(jīng)過航天誘變處理后生長狀態(tài)良好，基本保持成纖維細胞特性（圖2）?；厥蘸蟮捏w細胞生長到80%匯合度后，其中一部分用于傳代培養(yǎng)，其余全部進行冷凍保存。
2.2航天誘變組梅花鹿體細胞的生長曲線分析
根據(jù)3次實驗重復數(shù)據(jù)平均值得到的航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞的生長曲線，總體均呈“S”型生長趨勢，對照組梅花鹿體細胞經(jīng)培養(yǎng)2 d后進入對數(shù)生長期，航天誘變組梅花鹿體細胞經(jīng)培養(yǎng)4 d后進入對數(shù)生長期。兩個體細胞系的細胞都在培養(yǎng)7 d后出現(xiàn)生長速度減慢的現(xiàn)象。由此得出航天誘變的梅花鹿體細胞能夠在體外培養(yǎng)生長正常。通過3次實驗重復結(jié)果來看，每個細胞系生長曲線分析結(jié)果穩(wěn)定（圖3）。
2.3航天誘變組和對照組雌性梅花鹿體細胞的擬合生長曲線分析
Logistic曲線模型能很好地擬合3組航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞的生長曲線（表1），擬合度（R2）均接近1，說明其生長曲線的擬合度很好。拐點時間是細胞量增加速度由快到慢的轉(zhuǎn)折點，梅花鹿航天誘變組體細胞的拐點時間大于對照組拐點時間，即對照組梅花鹿體細胞早于航天誘變組樣品到達生長拐點。而從拐點細胞量來看，梅花鹿體細胞對照組的生長速度大于航天誘變組。
2.4航天誘變梅花鹿體細胞的核型
航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞的細胞中期分裂相分析結(jié)果顯示，染色體數(shù)目2n為66的分裂相分別占90%和94%。利用細胞遺傳工作站（AI）軟件根據(jù)其染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)對染色體序列進行排列。實驗觀察記錄了各100個航天誘變和對照組的梅花鹿體細胞染色體的形態(tài)，選擇分散良好且形態(tài)較好的中期分裂相進行顯微攝影、放大、比對、排列（圖4）。梅花鹿染色體核型（karyotype）2n=66，其中，32對常染色體，1對性染色體，X染色體為最大的染色體。其中航天誘變的梅花鹿體細胞未出現(xiàn)異常，且染色體形態(tài)正常。
3討論
3.1梅花鹿體細胞的航天誘變及細胞樣品回收培養(yǎng)技術(shù)
動物體細胞的正常培養(yǎng)條件是用液體培養(yǎng)基，其基礎(chǔ)營養(yǎng)成分中需要進一步添加血清并控制95%空氣和5%CO?的氣相條件，同時需要保持細胞滲透壓（osmotic pressure）在260~320 mOsm/kg（mOsm為milliosmol的縮寫，即毫滲量，是滲透壓的單位，1 mOsm/kg=2.575 kPa）和pH 7.2左右的酸堿度（power of hydrogen）。但是航天實驗從安全角度考慮，載物艙內(nèi)不能使用液體培養(yǎng)基，也沒有正常細胞培養(yǎng)的氣相控制條件，同時還伴有短時（10~20 min）高溫沖擊（溫度高于40℃），這些都是航天條件下進行動物細胞培養(yǎng)所面臨的主要問題?；谝陨锨闆r我們研制了PVDF膜培養(yǎng)基技術(shù)，基本保證細胞生長所需營養(yǎng)、pH和滲透壓等基本條件。實驗結(jié)果顯示，利用自主研發(fā)的PVDF膜動物細胞培養(yǎng)法，可以使鹿體細胞樣品在太空艙內(nèi)飛行12 d后，保持細胞活力并成功回收建系。其細胞經(jīng)過航天誘變處理后生長狀態(tài)良好，基本保持成纖維細胞特性。這種動物體細胞太空培養(yǎng)方法的開發(fā)為以后進行相關(guān)實驗提供了基礎(chǔ)技術(shù)支撐。
3.2生長曲線及擬合生長特點
本實驗采用臺盼藍染色直接計數(shù)法測定航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞的生長曲線。實驗步驟中最關(guān)鍵的是，確定所有組接種的細胞量要一致，即每孔接種細胞量為1×10?；向血球計數(shù)板中加入培養(yǎng)液時要勻速緩慢；確保計數(shù)準確，從而避免不必要的人為因素導致實驗結(jié)果不可信。通過3次重復的生長曲線測定實驗結(jié)果表明，本實驗的細胞計數(shù)板法計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性較好。Logistic模型參數(shù)在航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞間存在差異，其中代表極限細胞量的A值有較小差異，這說明航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞有差異；Logistic模型中B值（代表達到最大生長速率的參數(shù)）也存在差異，即航天誘變組梅花鹿體細胞最大生長速率出現(xiàn)得較對照組梅花鹿體細胞遲。航天誘變組和對照組梅花鹿體細胞生長速率參數(shù)差異很小。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果證明了對照組體細胞的生長速度大于航天誘變組生長速度。雖然航天誘變組體細胞生長速度不如對照組生長速度快，但其生長特性正常且良好。擬合生長曲線分析表明，與對照組相比航天誘變組細胞生長擬合度值相似，但細胞增殖拐點時間、拐點細胞量分析結(jié)果證明，航天誘變后的體細胞增殖速度減慢。增殖速度減慢有極大可能與細胞生長周期相關(guān)基因的表達有關(guān)。近幾年來，很多科研工作將較多的精力致力于細胞骨架系統(tǒng)中不同因素對細胞骨架分子聚合、解聚組裝的影響、細胞骨架調(diào)節(jié)的信號傳導途徑和基因表達研究。同時也有結(jié)果表明，重力可直接影響微管分子自組裝過程；微重力或模擬失重引起的細胞外基質(zhì)或整合素表達變化可影響ERK信號傳導途徑。因此后期實驗將以航天誘變處理的梅花鹿體細胞回收后生長速度減慢為依據(jù)，篩選出與細胞生長周期相關(guān)基因CCNE1、CDC34、CDK6、CKS2及ABL1，比較它們在對照組和航天誘變組梅花鹿體細胞中的表達量，從而為進一步了解航天誘變對梅花鹿體細胞影響提供理論依據(jù)。
3.3航天誘變梅花鹿體細胞核型
本實驗采用低滲滴片法制備染色體標本。實驗步驟中最關(guān)鍵的是，控制適宜的低滲時間，低滲時間過長導致細胞破裂，低滲時間不夠使得染色體鋪展不好；另外將玻片提前20~30 min放入?20℃的冰箱中，使用前5 min放入4℃冰柜中，確保在滴片時玻片上有一層水膜，也可提高中期分裂相的分散程度并得到理想的核型分析圖。本研究獲得了大量清晰的梅花鹿體細胞中期染色體相，觀察結(jié)果表明，航天誘變并沒有導致梅花鹿體細胞染色體形態(tài)和數(shù)量的變化，也沒有引起梅花鹿體細胞在細胞水平的遺傳學變化。由此推斷航天誘變過程中微重力（microgravity）、太空電磁波、太空輻射等與地球表面不同的物理條件可能導致梅花鹿體細胞在基因水平或基因表達水平上的某些變化。有關(guān)這一方面的研究，下一步我們將通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進一步研究其中的原因。