梅花鹿體細(xì)胞航天誘變、細(xì)胞樣品回收培養(yǎng)技術(shù)、生長(zhǎng)曲線及核型特性（二）
1.3.2具體實(shí)施方式
（1）PVDF膜軟化：將PVDF膜剪成3.5 cm×3.1 cm的長(zhǎng)方形小塊后，放入潔凈燒杯中進(jìn)行高壓滅菌。然后將PVDF膜置于10 cm培養(yǎng)皿中，加入適量Alpha-MEM培養(yǎng)液浸泡4~5 d。
（2）PVDF膜鋪板：用滅菌的手術(shù)鑷將軟化的PVDF膜鋪到6孔板中，并貼于孔底。
（3）接種細(xì)胞于PVDF膜培養(yǎng)：將細(xì)胞以（2~3）×10?的數(shù)目接種到鋪有PVDF膜的6孔板中，加入含有FBS的1×液體培養(yǎng)基，并置于5%CO?、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 d。
（4）“細(xì)胞-PVDF膜”導(dǎo)入凍存管：棄掉液體培養(yǎng)基，將貼附生長(zhǎng)成纖維細(xì)胞的PVDF膜卷入2 ml細(xì)胞凍存管中，并加入2 ml尚處于液體狀態(tài)下的0.5%瓊脂培養(yǎng)基。于室溫放置5 min后，液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基凝結(jié)為固體培養(yǎng)基。
（5）氣相平衡處理：將凍存管蓋在松弛狀態(tài)下放入5%CO?、37℃培養(yǎng)箱中平衡過(guò)夜，使凍存管中的氣相環(huán)境與培養(yǎng)箱相同。
（6）封口并標(biāo)記：第2天取出凍存管，蓋子擰緊后，用石蠟進(jìn)行密閉封口。貼上標(biāo)記細(xì)胞種類等詳細(xì)信息的標(biāo)簽并裝管。
（7）送樣上太空：將樣品送達(dá)指定地點(diǎn)，并在太空中（5~40℃，距地100~300 km）飛行12 d左右。
（8）細(xì)胞樣品回收：待返回艙落地后取回各細(xì)胞樣品，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行回收處理。將每個(gè)凍存管用酒精擦拭后放入超凈臺(tái)，取出PVDF膜，PBS沖洗2次后，加入3 ml 0.25%胰酶消化2次，每次5 min。加入同體積的1×液體培養(yǎng)基終止消化。沖洗用的PBS、消化和終止的液體培養(yǎng)基均收集到15 ml離心管中，1 500 r/min離心5 min。
（9）細(xì)胞培養(yǎng)：棄上清，加入1 ml液體培養(yǎng)基重懸，于5%CO?、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
（10）拍照、傳代和凍存：細(xì)胞生長(zhǎng)到80%匯合度后進(jìn)行拍照，其中一部分用于傳代培養(yǎng)，其余全部進(jìn)行冷凍保存。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初衷，是要獲得可以穩(wěn)定遺傳的航天誘導(dǎo)變異細(xì)胞系，這樣的細(xì)胞系才能用于育種材料。
1.4對(duì)照組梅花鹿體細(xì)胞的培養(yǎng)方法
同樣按照本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的新型成纖維細(xì)胞PVDF膜培養(yǎng)方法，即提供一種利用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和瓊脂固體培養(yǎng)基，把梅花鹿體細(xì)胞放入細(xì)胞凍存管，在室溫（25℃）避光條件下放置12 d作為對(duì)照組。
1.5航天誘變組和對(duì)照組梅花鹿體細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
本實(shí)驗(yàn)所用方法是臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法。將航天誘變組和對(duì)照組梅花鹿體細(xì)胞分別在24孔板中傳代培養(yǎng)到6~12代時(shí)，取3孔進(jìn)行生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)。具體操作是，棄去原有培養(yǎng)液，用DPBS沖洗細(xì)胞后，加入0.25％胰蛋白酶消化2~3 min。細(xì)胞脫壁后加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液終止消化，用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液（GIBCO公司）與各種細(xì)胞懸浮液以1︰9體積混合均勻，然后在倒置顯微鏡（Nikon TS100）下用XB-K-25血球計(jì)數(shù)板（中外合資上海求精生化試劑儀器有限公司）計(jì)數(shù)，在3 min之內(nèi)記下活細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算各樣品均值。按照上述實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)每個(gè)細(xì)胞樣品3次重復(fù)計(jì)數(shù)，每次實(shí)驗(yàn)共統(tǒng)計(jì)8 d。根據(jù)以上生長(zhǎng)曲線檢測(cè)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Logistic生長(zhǎng)模型進(jìn)行擬合生長(zhǎng)曲線分析。
1.6航天誘變組和對(duì)照組雌性梅花鹿體細(xì)胞的擬合生長(zhǎng)曲線分析
采用IBM SPSS Statistics 23統(tǒng)計(jì)軟件回歸分析程序中的非線性回歸分析子程序，得到相應(yīng)各個(gè)參數(shù)（parameter）的估計(jì)值（estimated value）與擬合度（degree of fitting）（R2值），參數(shù)A為極限細(xì)胞生長(zhǎng)量，即達(dá)到平臺(tái)期的細(xì)胞量，B為常數(shù)尺度（constant scale），k為瞬時(shí)相對(duì)生長(zhǎng)率（instantaneous relative growth rate），t為細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間（cell growth time），Y為細(xì)胞量（cell volume）。然后計(jì)算相關(guān)參數(shù)，包括初始細(xì)胞量、拐點(diǎn)細(xì)胞量（inflexion cell volume）和拐點(diǎn)時(shí)間（infiltration time）。根據(jù)初步模擬分析，選用Logistic數(shù)學(xué)模型擬合航天誘變組和對(duì)照組雌性梅花鹿體細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，模型表達(dá)式為Y=A/(1+B·e???)。比較生長(zhǎng)差異，即初始細(xì)胞量、拐點(diǎn)細(xì)胞量和拐點(diǎn)時(shí)間的差異。曲線擬合度指標(biāo)用相關(guān)指數(shù)衡量所擬合曲線的擬合度（R2）：
R2=1?∑(Y??)2/∑(Y??)2，
式中，Y表示實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞量，?表示擬合曲線估計(jì)細(xì)胞量，?表示實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞量的平均值。
1.7航天誘變組和對(duì)照組梅花鹿染色體標(biāo)本的制備和核型分析
參照張靜南等的方法，取培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板中處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的航天誘變組和對(duì)照組雌性梅花鹿體細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入新鮮配制的20 g/L的秋水仙素（Sigma），即在6孔培養(yǎng)板每孔2 ml的培養(yǎng)液中加入0.02 ml的秋水仙素。之后把細(xì)胞樣品再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5~3.0 h，取出培養(yǎng)板用0.25%胰酶消化3 min，加入含10%FBS的MEM-Apha培養(yǎng)液終止消化。1 500 r/min離心5 min，棄上清液，在離心管中收集細(xì)胞，用注射器在細(xì)胞沉淀中緩慢滴加37℃預(yù)熱好的0.075 mol/L KCl（Amresco）低滲液8 ml，用吸管吹打均勻。把細(xì)胞置于37℃恒溫水浴中低滲處理40 min。在低滲結(jié)束前1 min加入1 ml新鮮配制的固定液，即3︰1體積比的甲醇（西隴化工股份有限公司）與冰醋酸（天津化學(xué)試劑有限公司）混合液，對(duì)檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)固定，用吸管輕輕吹打均勻，1 000 r/min離心10 min，然后棄去上清液。用注射器在預(yù)固定的細(xì)胞沉淀中再次緩慢滴入8 ml固定液，混勻后置37℃恒溫水浴固定處理30 min，之后1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再次重復(fù)上述的固定程序2次。最后在細(xì)胞沉淀物中加入固定液0.5 ml，用吸管輕輕吹打均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液從1 m高處滴在冰水浸泡過(guò)的潔凈玻片上，自然晾干，即為常規(guī)染色體（chromosomes）標(biāo)本。染色體標(biāo)本用Giemsa液染色10~15 min，Giemsa液為Giemsa原液（Sigma）與純水按1︰9的比例稀釋，之后，自來(lái)水輕輕正反面沖洗后自然晾干、鏡檢。航天誘變組和對(duì)照組梅花鹿體細(xì)胞染色體標(biāo)本經(jīng)Giemsa染液染色完成后，運(yùn)用細(xì)胞遺傳工作站（applied imaging，AI）軟件分析結(jié)果。
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