貝氏柯克斯體在高滲脫水環(huán)境中的生物學(xué)特性研究（一）
摘要
目的基于無生命培養(yǎng)體系,探索建立貝氏柯克斯體耐受脫水的實(shí)驗(yàn)室研究模型。方法梯度調(diào)整貝氏柯克斯體無生命培養(yǎng)體系中的滲透壓條件,利用qPCR定量測定不同滲透壓下貝氏柯克斯體在培養(yǎng)周期內(nèi)基因組拷貝數(shù)變化并描記生長曲線,進(jìn)一步利用相差顯微鏡、透射電子顯微鏡對真核細(xì)胞以及無細(xì)胞培養(yǎng)方法所得貝氏柯克斯體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,并感染BGMK細(xì)胞測定不同滲透壓培養(yǎng)所得貝氏柯克斯體的感染性VFU。結(jié)果貝氏柯克斯體可在高滲透壓條件的無生命培養(yǎng)基中適應(yīng)性生存7 d以上,經(jīng)高滲透壓培養(yǎng)后的菌體脫水收縮且大小類似于小貝氏體,同時(shí)感染后24 h的VFU較對照組降低。結(jié)論成功建立了貝氏柯克斯體耐受高滲壓脫水的研究模型,為下一步用蛋白質(zhì)組學(xué)等方法研究貝氏柯克斯體在自然環(huán)境中耐受干燥脫水的遺傳學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii,C.burnetii)是一種世界范圍廣泛存在的革蘭氏陰性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,可通過氣溶膠吸入方式傳播感染人導(dǎo)致不明熱(Query fever,Q熱),故又稱Q熱立克次體。該病原對各種自然環(huán)境的抵抗力強(qiáng),可耐受多種外界失活條件如化學(xué)試劑、紫外輻照以及干燥脫水而存活致病,因而又被聯(lián)合國列為經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑與生物恐怖劑。傳統(tǒng)上,由于貝氏柯克斯體專性胞內(nèi)寄生的繁殖特性,一直以來該病原的研究局限于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?如豚鼠等哺乳動物的感染、雞胚接種以及細(xì)胞培養(yǎng)等,極大限制了該菌對脫水等無生命環(huán)境的耐受性研究。近年來,隨著多種無生命培養(yǎng)方法(Acidified Citrate Cysteine Media,ACCM)的研制,為進(jìn)一步研究貝氏柯克斯體耐受高滲透壓干燥脫水的生物學(xué)特性提供了全新技術(shù)平臺。
在自然環(huán)境中,目前貝氏柯克斯體被認(rèn)為大多以耐受干燥脫水環(huán)境的毒力菌株小貝氏體(Small Cell Variants,SCVs)存在,相反的,在體內(nèi)繁殖生長時(shí),貝氏柯克斯體表現(xiàn)為雙相發(fā)育周期,即在單個(gè)繁殖周期(7 d)內(nèi),由形態(tài)較小(<1μm)且具有感染性的小貝氏體(SCVs)向繁殖狀態(tài)的大貝氏體LCV(>0.5μm)轉(zhuǎn)變。這提示我們可利用無生命培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬體外環(huán)境,適應(yīng)性培養(yǎng)獲得貝氏柯克斯體并進(jìn)一步評估所得菌體是否具備類似于環(huán)境野生株的菌體形態(tài)以及感染性。與大多數(shù)革蘭陰性菌的無生命培養(yǎng)基組分含有高濃度的K+不同,各代ACCM培養(yǎng)基均具有高濃度Na+(~125 mmol/L)而非K+(~5 mmol/L)。作為維持無生命培養(yǎng)基滲透壓以及貝氏柯克斯體二分裂繁殖外環(huán)境的重要組分,Na+與Cl-終濃度的變化可以使菌體暴露在高滲壓脫水環(huán)境下,從而可實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬外界環(huán)境中的脫水條件。本研究以無生命培養(yǎng)體系為基礎(chǔ),實(shí)驗(yàn)室模擬外界脫水環(huán)境并對適應(yīng)性存活的貝氏柯克斯體生物學(xué)特性進(jìn)行了評價(jià),目的是在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立貝氏柯克斯體耐受高滲壓脫水的研究模型。
1材料與方法
1.1材料和儀器
貝氏柯克斯體九里II相菌株(Nine Mile phase II,NM II)、綠猴腎細(xì)胞(BGMK)均由本科室超低溫保存;全基因組DNA純化提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑購自美國Qiagen公司;PCR反應(yīng)所需引物及Taqman探針由上海生工生物公司合成;實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑購自上海生工公司并均為分析純級別。實(shí)時(shí)熒光定量分析儀ABI 7300購自ABI(Applied Biosystems)公司;倒置相差顯微鏡TS100購自日本尼康公司;透射電子顯微鏡H-7600購自日本Hitachi公司;恒溫低氧培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。
1.2可耐受高滲壓脫水存活貝氏柯克斯體的培養(yǎng)
依據(jù)國外已報(bào)道的方法,分別準(zhǔn)確配置不含Na+及Cl-的無生命培養(yǎng)基ACCM-2(-NaCl),以及終濃度為0.3 g/mL的氯化鈉母溶液。將氯化鈉母溶液分別以終濃度1 250 mmol/L、125 mmol/L、1.25 mmol/L加入24孔板內(nèi)的ACCM-2(-NaCl)無生命培養(yǎng)基中,完成高滲壓組(ACCM+10×NaCl,3 500 mOsm/L)、常規(guī)組(ACCM-2,345 mOsm/L)及低滲組(ACCM+1/100×NaCl,40 mOsm/L)培養(yǎng)基的制備,如表1所示。分別向上述ACCM培養(yǎng)基中加入106拷貝的貝氏柯克斯體九里II相菌種,每組均平行重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),后將24孔板置于2.5%O2,5%CO2,37℃的恒溫低氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d。
表1滲透壓梯度無生命培養(yǎng)基配制條件
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