脂肽對(duì)蜜蜂球囊菌生長(zhǎng)抑制作用及其孢子萌發(fā)的影響（三）
2.2體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1抑菌圈試驗(yàn)
由圖3可知，Iturin和Fengycin對(duì)蜜蜂球囊菌有抑制作用,Iturin的抑制作用最強(qiáng),抑菌圈半徑達(dá)8.53 mm,其次是Fengycin,抑菌圈半徑為5.84mm,Surfactin對(duì)蜜蜂球囊菌無(wú)抑制作用。Iturin抑菌效果最好，選其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
2.2.2 MIC和MFC測(cè)定
由圖4可知，Iturin濃度為0.2~3.13μg/mL時(shí)，蜜蜂球囊菌D???nm值較高;Iturin濃度為3.13~25μg/mL時(shí),D???nm值持續(xù)變低;當(dāng)Iturin濃度>25μg/mL時(shí)，達(dá)到最大抑菌效果。累積分布率統(tǒng)計(jì)表明，Iturin濃度為3.13μg/mL時(shí)，可抑制2株菌株(累積分布率2/55);濃度升至6.25μg/mL時(shí)，抑菌范圍擴(kuò)大至26株，使累積抑菌株數(shù)達(dá)28株(累積分布率28/55),確定Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌的MIC??值為6.25μg/mL。Iturin濃度為25μg/mL時(shí)，所有受試菌株均被抑制(累積分布率55/55)，確定Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌的MIC??值為25μg/mL(表2)。
MFC試驗(yàn)中陰性對(duì)照沒(méi)有蜜蜂球囊菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照蜜蜂球囊菌全部生長(zhǎng)，Iturin濃度為6.25、12.5、25μg/mL時(shí)蜜蜂球囊菌生長(zhǎng)，Iturin濃度為50、100μg/mL時(shí)無(wú)蜜蜂球囊菌生長(zhǎng)，Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌的MFC是50μg/mL(表3)。
表2 Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌的MIC
表3 Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌的MFC
2.3抑菌機(jī)制探究
2.3.1 Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌孢子的影響
由圖5可知,與對(duì)照組相比,Iturin各濃度組蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)率均顯著下降(P<0.05)。PI染色結(jié)果顯示,對(duì)照組中孢子幾乎未被染色;隨著Iturin濃度增大,被PI染色的孢子(紅色熒光斑點(diǎn))數(shù)量逐漸上升,當(dāng)Iturin濃度為50μg/mL時(shí),大量孢子被染色,呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的紅色熒光反應(yīng)(圖6)。
2.3.2 Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌細(xì)胞膜的影響
由圖7可知,隨著Iturin濃度的升高,麥角甾甾醇含量逐漸降低。與對(duì)照組相比，當(dāng)Iturin濃度為12.5、25和50μg/mL時(shí),麥角甾甾醇含量分別下降了52.18%、60.69%和67.12%,差異顯著(P<0.05)。
2.3.3 Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌細(xì)胞壁的影響
由圖8可知,與對(duì)照組相比,Iturin各濃度處理組幾丁質(zhì)含量分別下降了17.39%、22.58%、30.69%和32.94%,25和50μg/mL Iturin組幾丁質(zhì)含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
3討論
本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，分離菌株在PDA培養(yǎng)基上形成典型的白色絨毛狀菌落，顯微觀察可見(jiàn)具有隔膜的分枝狀菌絲結(jié)構(gòu)。其孢子呈橢圓形，大小為(2.8~2.9)μm×(1.4~1.5)μm,孢子囊直徑為69~80μm,與余林生等報(bào)道的蜜蜂球囊菌特征一致。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定顯示，菌株18S rDNA PCR擴(kuò)增獲得大小約600bp的特異性條帶，與戚偉等研究中報(bào)道的一致。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中蜜蜂球囊菌(登錄號(hào):GQ867785.1)相似性達(dá)100%。該綜合鑒定方法確保了菌株鑒定的準(zhǔn)確性。
抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，Iturin抑菌效果呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性，3.13~25μg/mL范圍內(nèi)抑菌作用逐漸增強(qiáng)，25μg/mL時(shí)達(dá)到最大效果。孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)證實(shí)其抑制率與濃度呈正相關(guān)(6.25~50μg/mL)。相比對(duì)其他病原菌的MIC值(鐮刀霉51.8μg/mL,灰葡萄孢霉37.0μg/mL),Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌顯示出更強(qiáng)的抑制活性，表明其具有高效、廣譜的抗真菌特性。
麥角甾甾醇作為真菌細(xì)胞膜的重要組成成分，在維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性、通透性和穩(wěn)定性等方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Iturin處理可顯著降低蜜蜂球囊菌細(xì)胞膜麥角甾甾醇含量。試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)Iturin濃度≥12.5μg/mL時(shí)，麥角甾甾醇含量較對(duì)照組下降52.18%~67.12%，表明Iturin可能干擾真菌細(xì)胞膜的生物合成。現(xiàn)有研究表明，Iturin的膜破壞作用具有多靶點(diǎn)特征。首先，抑制NADPH氧化酶誘導(dǎo)氧化應(yīng)激;其次，激活鉀通道致K?失衡，上述機(jī)制與本研究中觀察到的麥角甾甾醇含量降低現(xiàn)象具有潛在關(guān)聯(lián)性。此外，還可直接破壞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，這一觀點(diǎn)與本研究中檢測(cè)到的膜通透性改變結(jié)果相呼應(yīng)。這些機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞膜狀態(tài)發(fā)生改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。
幾丁質(zhì)作為真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，在維持細(xì)胞形態(tài)和機(jī)械強(qiáng)度方面起著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Iturin處理可顯著影響蜜蜂球囊菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的含量，表明Iturin能有效干擾細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。基于本試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)Iturin可能通過(guò)以下機(jī)制影響細(xì)胞壁合成:幾丁質(zhì)含量的顯著降低提示Iturin可能干擾了幾丁質(zhì)合成酶的活性;細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度的下降表明β-1,3-葡聚糖的合成可能也受到抑制;細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控可能受到影響，MAPK信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制為此提供了可能的解釋路徑。故Iturin可通過(guò)多重分子機(jī)制破壞細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)缺陷和機(jī)械強(qiáng)度下降。這種多靶點(diǎn)作用模式使真菌細(xì)胞難以維持正常形態(tài)和滲透壓平衡，進(jìn)而抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)等關(guān)鍵生理過(guò)程，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。
綜上所述，本研究揭示了Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌的抑菌活性及其機(jī)制，為新型抗真菌劑的研發(fā)提供了重要理論依據(jù)。這些研究成果不僅拓展了Iturin對(duì)蜜蜂球囊菌抑菌機(jī)制的深入了解，更為蜜蜂球囊菌病害防控開(kāi)辟了新的技術(shù)方向。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中,Iturin有望成為保障蜜蜂健康、維護(hù)生態(tài)平衡的重要技術(shù)手段，對(duì)促進(jìn)蜂業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)研究可進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)和田間應(yīng)用,深入評(píng)估其實(shí)際應(yīng)用效果,加速推進(jìn)相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
4結(jié)論
本研究從患白堊堊病蜜蜂幼蟲(chóng)中成功分離純化蜜蜂球囊菌，脂肽Fengycin和Iturin可抑制蜜蜂球囊菌菌絲生長(zhǎng)，Iturin作用效果最好，Surfactin無(wú)抑制作用。Iturin在48h對(duì)蜜蜂球囊菌的MIC??、MIC??和MFC分別為6.25、25和50μg/mL。Iturin可有效抑制菌絲生長(zhǎng)、蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)，并破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。
相關(guān)新聞推薦
1、苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（一）
2、基于生長(zhǎng)速率法評(píng)估植物乳桿菌Bx6-2的發(fā)酵液對(duì)甜瓜疫霉菌抑制效果（二）
3、如何縮短微生物藥敏試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間