棘孢木霉TCS007菌株的固態(tài)發(fā)酵條件、次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量影響因素（二）
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1菌株活化培養(yǎng)
TCS007菌株活化：從解凍的甘油管中取10μL TCS007菌株菌液，涂布于PDA平板，于28℃倒置暗培養(yǎng)5 d后，在無(wú)菌環(huán)境下用直徑8 mm的無(wú)菌打孔器切取菌餅，接種至PDA平板中央，于28℃倒置暗培養(yǎng)5 d，備用。
植物病原真菌活化：用無(wú)菌接種針從解凍的冷凍管中挑取菌絲，接種于PDA平板上，于26℃倒置暗培養(yǎng)7 d，備用。
1.2.2種子液制備
在無(wú)菌環(huán)境下，用無(wú)菌水沖洗長(zhǎng)至培養(yǎng)皿直徑2/3的TCS007菌株，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲，獲得TCS007菌株的分生孢子懸浮液。采用μCount3D立體計(jì)數(shù)儀測(cè)定孢子含量，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)節(jié)至1×107個(gè)/mL種子液，備用。
1.2.3固態(tài)發(fā)酵方法及粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量測(cè)定
1.2.3.1固態(tài)發(fā)酵法
稱取72 g大米，倒入300 mL三角瓶中，加入48 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，封口滅?0 min后，在無(wú)菌環(huán)境下接入1 mL TCS007菌株種子液，置于28℃霉菌培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)21 d。
1.2.3.2淺盤(pán)發(fā)酵法
稱取216 g大米和7.56 g黃豆粉，倒入500 mL三角瓶中，加入141 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢瑁饪跍缇?0 min后，在無(wú)菌環(huán)境下接入3 mL TCS007菌株種子液，置于28℃霉菌培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d后，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到淺盤(pán)(21 cm×33 cm×4 cm)中，用保鮮膜密封，并在上方用細(xì)針均勻開(kāi)孔透氣。
1.2.3.3粗提發(fā)酵產(chǎn)物的制備及產(chǎn)量計(jì)算
將棘孢木霉TCS007菌株發(fā)酵物與乙酸乙酯等體積互溶萃取3次，并充分?jǐn)嚢韬喜⑤腿∫汉箪o置24 h后抽濾；得到的萃取液再經(jīng)過(guò)0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾3次，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸減壓濃縮至干；用乙酸乙酯復(fù)溶后收集于離心管中，待溶劑揮發(fā)后即得到TCS007菌株的粗提發(fā)酵產(chǎn)物，稱量備用。在每組處理中，保持固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的大米質(zhì)量為72 g不變，因此后文提到的TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量(單位g)均為72 g大米前提下的產(chǎn)量。
1.2.4 TCS007菌株固態(tài)發(fā)酵條件單因素優(yōu)化試驗(yàn)
1.2.4.1培養(yǎng)基組分優(yōu)化
在初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別利用1%速效碳、氮源篩選法和遞進(jìn)法進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)基單因素優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)置分別為：1)以添加的碳源為唯一變量，分別添加大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的蔗糖、果糖、葡萄糖、α-乳糖和甘露醇，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共5個(gè)處理組；2)以添加的氮源為唯一變量，分別添加大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的尿素、蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨和酵母粉，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共5個(gè)處理組；3)以添加的無(wú)機(jī)鹽為唯一變量，分別添加大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的無(wú)水MnSO4、NaCl、MgSO4、CaCl2和FeCl3，設(shè)不添加無(wú)機(jī)鹽的對(duì)照組，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共6個(gè)處理組。上述試驗(yàn)各組處理均重復(fù)3次。
1.2.4.2培養(yǎng)條件優(yōu)化
在初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，發(fā)酵條件單因素優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)置分別為：1)以加水量為唯一變量，分別加入24、36、48、60和72 mL蒸餾水，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共5個(gè)處理組。2)以接種量為唯一變量，分別接入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL種子液，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共5個(gè)處理組。3)以初始pH為唯一變量，分別用1 mol/L的稀鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蒸餾水pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共9個(gè)處理組。4)以培養(yǎng)時(shí)間為唯一變量，分別設(shè)定為7、14、21、28、35和42 d，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共6個(gè)處理。5)以培養(yǎng)溫度為唯一變量，分別將培養(yǎng)基置于22、25、28、31和34℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共5個(gè)處理。6)以光照周期為唯一變量，將培養(yǎng)箱的光照周期分別調(diào)節(jié)為24 h光照/0 h黑暗、18 h光照/6 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗、6 h光照/18 h黑暗以及0 h光照/24 h黑暗，其他發(fā)酵參數(shù)不變，共5個(gè)處理。上述試驗(yàn)各組處理均重復(fù)3次。
1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.5.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)
以單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，綜合考慮發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對(duì)TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，選擇8個(gè)影響顯著的因素。根據(jù)Placket-Burman設(shè)計(jì)法，采用軟件Design Expert 10針對(duì)選出的8個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量為響應(yīng)量，從A1-培養(yǎng)時(shí)間(7~42 d)、B1-初始pH(3.0~11.0)、C1-培養(yǎng)溫度(22~34℃)、D1-光照周期(0~24 h光照)、E1-加水量(24~72 mL)、F1-接種量(0.5~2.5 mL)、G1-葡萄糖添加量(1.0%~5.0%)和H1-黃豆粉添加量(1.0%~5.0%)8個(gè)因素中確定各因素對(duì)粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量影響的顯著性，篩選關(guān)鍵因子。試驗(yàn)中每個(gè)因素取2個(gè)水平，即高水平“+1”和低水平“?1”(表1)。
表1 Placket-Burman設(shè)計(jì)變量與水平
1.2.5.2最陡爬坡設(shè)計(jì)
基于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子試驗(yàn)篩選結(jié)果，分別從以上因素中篩選出3個(gè)最關(guān)鍵的影響因子，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。根據(jù)模型中各變量的系數(shù)，確定關(guān)鍵因素的爬坡方向和步長(zhǎng)，確定關(guān)鍵因素的最優(yōu)范圍，以所得的TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量最高點(diǎn)為中心，組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。
1.2.5.3關(guān)鍵因素中心組合試驗(yàn)
采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)3因子3水平中心組合試驗(yàn)(表2)，對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)因子Y2為TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量，分析試驗(yàn)結(jié)果，預(yù)測(cè)棘孢木霉TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到最大值時(shí)所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵因子參數(shù)。
表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)變量與水平
1.2.6優(yōu)化后固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的制備
將采用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基及最優(yōu)發(fā)酵條件所得的TCS007菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與溶劑乙酸乙酯等體積互溶萃取3次，合并萃取液，抽濾；先加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，再旋蒸濃縮至干；用乙酸乙酯復(fù)溶后收集于離心管中，待溶劑揮發(fā)完即得到TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物，稱量備用。
1.2.7粗提發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性測(cè)定
采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。先用DMF將TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物配制成10 g/L的母液，再用無(wú)菌水梯度稀釋至500 mg/L。吸取12 mL藥液，加入滅菌后的PDA培養(yǎng)基(108 mL)中，充分搖勻后倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，制成藥劑最終質(zhì)量濃度為50 mg/L的含藥PDA平板。同時(shí)配制啶酰菌胺最終質(zhì)量濃度為10 mg/L的含藥平板，作為陽(yáng)性對(duì)照。在無(wú)菌條件下，于預(yù)培養(yǎng)好的各植物病原真菌菌落邊緣打取直徑8 mm的菌餅，倒置接種于各組PDA平板中央，于培養(yǎng)箱中(26±1)℃條件下倒置培養(yǎng)。待菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，各處理重復(fù)3次，取平均值，按(1)式計(jì)算粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率(Im，%)。
式中，D1：空白對(duì)照平板中形成的菌落直徑，mm；D2：供試含藥平板中形成的菌落直徑，mm。
1.2.8粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌菌核形成與萌發(fā)的影響
菌核的形成：在無(wú)菌條件下制備含EC50濃度TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物的PDA平板，以空白PDA為對(duì)照。待培養(yǎng)基冷卻干燥后，于預(yù)培養(yǎng)好的油菜菌核病菌菌落邊緣打取直徑8 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)15 d后，對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)菌核的分布及色澤進(jìn)行觀察，并統(tǒng)計(jì)各皿內(nèi)的菌核數(shù)量。
菌核的萌發(fā)：從正常培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中取出大小相同的油菜菌核病菌菌核，對(duì)其進(jìn)行表面消毒，并用EC50濃度的TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物浸泡30 min，每次30粒。浸泡后取出菌核，干燥后移至空白PDA平板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中(26±1)℃下培養(yǎng)，每12 h對(duì)觀察1次，并統(tǒng)計(jì)菌核萌發(fā)的數(shù)量，以未浸泡處理的菌核為對(duì)照。按(2)式計(jì)算粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)菌核萌發(fā)的抑制率(Is，%)。
式中，G1：空白對(duì)照平板中菌核的萌發(fā)數(shù)，粒；G2：供試含藥平板中菌核的萌發(fā)數(shù)，粒。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
單因素試驗(yàn)采用SPSS 26軟件進(jìn)行方差分析(analysis of variance，ANOVA)，并對(duì)方差分析結(jié)果進(jìn)行多重檢驗(yàn)(P<0.05)，通過(guò)Graphpad prism 9軟件進(jìn)行繪圖。響應(yīng)曲面法試驗(yàn)采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)分析。
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