Mg2?對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌生長、氧化活性的影響規(guī)律——摘要、材料和方法
摘要：以嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，簡稱At.f菌，F(xiàn)N811931）為研究對象，探討了Mg2?對其氧化活性的影響規(guī)律，并采用Zeta電位及紅外光譜分析，考察了其影響的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明：在Mg2?質(zhì)量濃度小于5.0 g/L的體系中，培養(yǎng)35 h時(shí)，pH值從培養(yǎng)初期的2.00左右下降到1.70左右，氧化還原電位從培養(yǎng)初期的390 mV左右上升到600 mV以上，F(xiàn)e2?氧化率接近100%，細(xì)菌生長達(dá)到旺盛期；當(dāng)Mg2?質(zhì)量濃度超過5.0 g/L時(shí)，體系pH值下降速率、氧化還原電位上升速率、Fe2?氧化率、細(xì)菌生長速率均降低，且Mg2?質(zhì)量濃度越大，影響效果越顯著。Zeta電位測試結(jié)果表明，20.0 g/L鎂離子作用下細(xì)菌等電點(diǎn)為3.6，高于9K培養(yǎng)基中細(xì)菌的等電點(diǎn)2.7，這從宏觀上解釋了細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化；紅外光譜測試結(jié)果顯示，Mg2?作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁中的官能團(tuán)發(fā)生了交聯(lián)作用，導(dǎo)致吸收峰N-H的消失和—OH、—C=O、—CH?、—CH?、—P=O、—CN的偏移，致使細(xì)胞壁表面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響了細(xì)菌的氧化活性。
氧化亞鐵硫桿菌是通過氧化亞鐵離子與單質(zhì)硫或含硫化合物獲取能量生長的嗜酸性化能自養(yǎng)菌，是常見的硫化礦浸出功能菌。黃銅礦是自然界中最主要的銅礦物，也是最難浸出的礦物之一，石榴石、橄欖石、蛇紋石及白云石等是黃銅礦中常見的共伴生脈石礦物，細(xì)菌氧化浸出時(shí)其溶出的Mg2?在體系中不斷積累，不僅會影響銅的浸出效率，而且對浸礦微生物的生長活性也有顯著影響。然而Mg2?又是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，簡稱At.f菌）生長發(fā)育必需的元素之一，是構(gòu)成某些酶的活性成分，對微生物細(xì)胞膜、核糖體等的穩(wěn)定性起著重要作用，因此存在適宜Mg2?含量問題。若Mg2?含量不足，會導(dǎo)致核糖體與細(xì)胞膜的穩(wěn)定性降低，從而影響機(jī)體的正常生長；Mg2?含量過高則會抑制細(xì)菌的生長。關(guān)于Mg2?對氧化亞鐵硫桿菌的影響，李洪枚等研究了馴化菌株與正常菌株耐鎂性能的影響；劉欣偉等從動力學(xué)角度描述了Mg2?濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長的影響，但從細(xì)菌表面電位及紅外光譜分析方面揭示其對細(xì)菌氧化活性的影響研究較少。
構(gòu)成At.f菌細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)是由肽鏈和氨基糖鏈組成的肽聚糖及其他多糖、蛋白質(zhì)、粘多糖等成分，這些化學(xué)成分決定了細(xì)菌表面帶有負(fù)電荷，細(xì)菌表面電位與帶電微粒所帶電荷的大小成正比，且可以通過測定細(xì)菌的Zeta電位值判斷細(xì)菌表面所帶電荷的量。傅里葉變換紅外光譜技術(shù)可以靈敏地反映出細(xì)胞分子層面的改變，具有操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，如今已被廣泛應(yīng)用。應(yīng)用FT-IR光譜技術(shù)可讀取微生物菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)包括肽聚糖、脂多糖、磷脂雙分子層、蛋白質(zhì)、水、脂肪、多糖以及核酸等所有組成成分化學(xué)鍵的振動情況，提供整個(gè)微生物菌體生化組成成分的光譜定量信息。
因此，文中以At.f菌為研究對象，以細(xì)菌生長過程中體系的pH值、Eh（氧化還原電位）值、Fe2?氧化率、細(xì)菌濃度等實(shí)時(shí)參數(shù)的變化來反映培養(yǎng)體系中Mg2?濃度變化對At.f菌氧化活性影響的規(guī)律，并通過Zeta電位及紅外光譜技術(shù)揭示Mg2?濃度對細(xì)菌氧化活性影響的內(nèi)在機(jī)制，為獲得浸礦細(xì)菌的最優(yōu)生長和氧化活性條件提供理論依據(jù)。
1實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1菌種及培養(yǎng)基
試驗(yàn)所需浸礦菌種經(jīng)鑒定為嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌，同源度為99.99%，其16S rDNA gene基因庫登錄序列號為FN811931。菌種最佳培養(yǎng)條件如下：搖床溫度30℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，初始pH值2.0，采用9K培養(yǎng)基。
微生物的富集培養(yǎng)采用9K培養(yǎng)基，其組成為：①(NH?)?SO?3.00 g，KCl 0.10 g，K?HPO?0.50 g，MgSO?·7H?O 0.50 g，Ca(NO?)?0.01 g，蒸餾水700 mL，121℃滅菌20 min；②FeSO?·7H?O 44.20 g，蒸餾水300 mL，pH=2.0，經(jīng)微孔濾膜（?0.22μm）真空抽濾除菌。將①、②混合后使用。
1.2試驗(yàn)方法
Mg2?對At.f菌氧化活性的影響試驗(yàn)在250 mL錐形瓶中進(jìn)行，在90 mL經(jīng)滅菌后的9K培養(yǎng)基中，加入不同濃度梯度的分析純硫酸鎂，配制體系Mg質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L（0 g/L代表不加入Mg2?時(shí)的空白試驗(yàn)），調(diào)節(jié)酸平衡至pH=2.0后，接入培養(yǎng)好的At.f菌，接種量為10%，細(xì)菌濃度為1.0×10?個(gè)/mL，并設(shè)置重復(fù)3組。定期測定體系中的pH值、Eh值和Fe2?濃度。蒸發(fā)掉的水分用蒸餾水補(bǔ)足，取樣消耗的溶液量用相同體積的、pH=2.0的稀硫酸補(bǔ)充，以保證溶液總體積不變。
1.3分析方法
采用Mettler320型pH計(jì)測量培養(yǎng)液pH值的變化；采用BPP-922型臺式ORP計(jì)檢測培養(yǎng)液中氧化還原電位值的變化；細(xì)菌濃度采用血球計(jì)數(shù)法測定；培養(yǎng)液中Fe2?濃度采用重鉻酸鉀法滴定；菌種的氧化活性用細(xì)菌氧化亞鐵的能力來表示。n小時(shí)后Fe2?氧化率的計(jì)算公式為：
采用美國布魯克海文公司生產(chǎn)的Zeta Plus高分辨率Zeta電位分析儀測試細(xì)菌表面電位。取菌懸液加入到離子強(qiáng)度I=0.001 mol/L的KCl溶液中，細(xì)菌濃度控制在1×10?個(gè)/mL，稍微攪拌，使其均勻分散，然后進(jìn)行細(xì)菌Zeta電位的測定，測試中采用HCl和KOH溶液調(diào)節(jié)pH值，每個(gè)樣品測量3次，取其平均值。
細(xì)菌紅外光譜分析采用美國Nicolet Nexus670型傅里葉變換紅外光譜儀測定，采用4000~400 cm?1的檢測波，測定波數(shù)范圍為11000~400 cm?1，波數(shù)分辨率<0.1 cm?1，噪聲信號<5000:1（峰峰間），掃描速率>20遍/s，且至少9種。取對數(shù)生長期的菌液，過濾去除雜質(zhì)，將濾液在離心機(jī)中離心20 min，轉(zhuǎn)速5000 r/min，獲得的細(xì)菌重新分散于蒸餾水中，同樣條件下離心處理，反復(fù)多次后，經(jīng)冷凍干燥后用于細(xì)菌的FT-IR檢測。
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