副溶血弧菌活菌計(jì)數(shù)方法：MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長(zhǎng)曲線（四）
2.4副溶血弧菌菌液檢測(cè)
分別采用MTT比色法、ATP發(fā)光法和高通量生長(zhǎng)曲線法對(duì)10份不同濃度的副溶血弧菌菌液進(jìn)行檢測(cè)，并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較(圖9)。結(jié)果顯示，MTT法計(jì)數(shù)的9個(gè)在線性范圍內(nèi)的樣品計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)(LgCMTT)與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的對(duì)數(shù)(LgCP)之間具有極顯著的線性關(guān)系(R2=0.9620，P=3.42×10-7)，其關(guān)系式為L(zhǎng)gCMTT/LgCP=1.0123(圖9)。9個(gè)樣品的變異系數(shù)為(18.50±12.03)%，超出檢測(cè)線性范圍的1個(gè)樣品的濃度為4.82×106 CFU/ml，其變異系數(shù)為36.61%。ATP發(fā)光法計(jì)數(shù)的9個(gè)在線性范圍內(nèi)的樣品計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)(LgCATP)與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果的對(duì)數(shù)(LgCP)之間具有極顯著的線性關(guān)系(R2=0.9981,P=1.72×10-11)，其關(guān)系式為L(zhǎng)gCATP/LgCP=0.9981(圖9)。9個(gè)樣品的變異系數(shù)為(8.59±5.90)%，超出檢測(cè)線性范圍的1個(gè)樣品的濃度為6.43×103 CFU/ml，其變異系數(shù)為23.65%。高通量生長(zhǎng)曲線法計(jì)數(shù)的9個(gè)在線性范圍內(nèi)的樣品計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)(LgCG)與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的對(duì)數(shù)(LgCP)之間具有極顯著的線性關(guān)系(R2=0.9985,P=3.89×10-11)，其關(guān)系式為L(zhǎng)gCG/LgCP=0.9985(圖9)。9個(gè)樣品的變異系數(shù)為(9.78±7.46)%，超出線性范圍的1個(gè)樣品的濃度為77.00 CFU/ml，其變異系數(shù)為68.43%。
圖9 3種高通量活菌計(jì)數(shù)法與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果比較
上述3種方法與平板計(jì)數(shù)法的比較顯示，ATP發(fā)光法和高通量生長(zhǎng)曲線法的曲線斜率很接近1，說(shuō)明這2種方法與平板計(jì)數(shù)法得出的結(jié)果高度接近，而MTT法的斜率與1有所偏離，而且在偏低或偏高濃度上有明顯系統(tǒng)誤差，說(shuō)明這一方法所得結(jié)果存在一定誤差。
3討論
平板計(jì)數(shù)作為活菌計(jì)數(shù)的最基本方法，通常能應(yīng)用于大多數(shù)需要進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的場(chǎng)合，但在一些研究不同培養(yǎng)條件，例如液體發(fā)酵(高戈等,2017)或固體發(fā)酵(孫靜等,2017)等；理化因素，例如消毒劑或紫外線等處理；藥物制劑，例如中草藥或抑菌劑等；這些對(duì)特定細(xì)菌生長(zhǎng)或存活的影響效果時(shí)，需要大量的活菌計(jì)數(shù)工作，而平板計(jì)數(shù)方法由于工作量大，材料消耗大，在用到這些大量研究對(duì)象時(shí)效率很低，且不確定度高(凌云等,2010)，因此，需要高效可靠的活菌計(jì)數(shù)方法。工作效率較高的細(xì)菌計(jì)數(shù)法可采用酶標(biāo)板的高通量OD值測(cè)定，但該方法并不能區(qū)分樣本中的活菌和死菌，而且如果樣本中存在大量帶顏色的或懸浮物等干擾光吸收的物質(zhì)時(shí)(孫靜等,2017)，就難以進(jìn)行直接的OD值測(cè)定。因此，需要其他的活菌計(jì)數(shù)方法以彌補(bǔ)在特定應(yīng)用中的不足。
MTT比色法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能滿足高通量操作的需求，適用于較高濃度的活菌數(shù)檢測(cè)，但其檢測(cè)的線性范圍只有2個(gè)數(shù)量級(jí)的跨度。當(dāng)活菌數(shù)較低時(shí)，MTT的反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)低，從而在OD555 nm值太低而超出檢測(cè)的線性范圍，不適用于檢測(cè)濃度太低或太高的細(xì)菌，由于高通量分析實(shí)驗(yàn)的場(chǎng)合常常會(huì)有細(xì)菌數(shù)量大大偏離MTT檢測(cè)范圍的情況發(fā)生，這種方法實(shí)際上在高通量活菌計(jì)數(shù)的應(yīng)用中受到了較大局限，與之前報(bào)道的MTT比色法在大腸桿菌活菌計(jì)數(shù)研究的結(jié)論相符合(汪志榮等,2011)。對(duì)7.8×106~2.5×108 CFU/ml線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果有一定偏離，5×106 CFU/ml以下的檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有明顯偏差。此外，不同種類(lèi)和不同生理狀態(tài)的細(xì)菌中琥珀酸脫氫酶含量可能不同，對(duì)多種細(xì)菌混合檢測(cè)的適用性可能受影響。
ATP生物發(fā)光法操作更加簡(jiǎn)便，是3種方法中檢測(cè)速度最快的，準(zhǔn)確性比MTT法高，反應(yīng)速度較快，能對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)反饋，線性范圍能達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí)的跨度。對(duì)1×104~3×108 CFU/ml跨度的線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果高度吻合，對(duì)104 CFU/ml以下的檢測(cè)結(jié)果偏差明顯增加(Chen et al,2006)。在檢測(cè)較低濃度的活菌時(shí)，需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間來(lái)收集微弱的發(fā)光，對(duì)于大量樣品的高通量檢測(cè)來(lái)說(shuō)，順序檢測(cè)過(guò)程會(huì)造成前后樣品的時(shí)間差太大，ATP的發(fā)光會(huì)逐漸消散而對(duì)準(zhǔn)確性造成顯著影響(發(fā)光會(huì)逐漸消散而對(duì)準(zhǔn)確性造成顯著影Selan et al,1992)。因此，該方法也不適于大樣本量的高通量檢測(cè)。此外，如果樣品中有其他來(lái)源的ATP干擾，也會(huì)對(duì)分析的準(zhǔn)確性產(chǎn)生很大的影響。
高通量生長(zhǎng)曲線法準(zhǔn)確性略低于ATP發(fā)光法，在本研究的手動(dòng)操作條件下，檢測(cè)的線性范圍達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)以上，對(duì)特別低或特別高的活菌數(shù)都能進(jìn)行有效檢測(cè)。對(duì)100~107 CFU/ml跨度的線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果高度吻合，102 CFU/ml以下的實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)有誤差增大的可能，與Brewster(2003)的研究結(jié)果相符。高通量生長(zhǎng)曲線法操作耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，而且需要定時(shí)對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定，如果完全人工手動(dòng)操作，這個(gè)過(guò)程將較為辛苦。該方法不需要借助特別試劑，可以不受試劑缺乏的限制而得以應(yīng)用。如果有自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀，那這樣的操作將十分方便，而且能進(jìn)一步增加其檢測(cè)的線性范圍和結(jié)果的準(zhǔn)確性。
綜合比較3種高通量方法：ATP生物發(fā)光法與高通量生長(zhǎng)曲線法有很好的準(zhǔn)確性，MTT比色法準(zhǔn)確度稍差；而高通量生長(zhǎng)曲線法有最寬的線性范圍，也最適合高通量測(cè)定。
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