副溶血弧菌活菌計(jì)數(shù)方法：MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長曲線法（一）
摘要：以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作為研究對象，比較了MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長曲線法在活細(xì)菌高通量計(jì)數(shù)上的應(yīng)用效果。用96孔培養(yǎng)板進(jìn)行不同濃度細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)，確定了上述3種方法在副溶血弧菌活菌計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍。結(jié)果顯示，副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT產(chǎn)物甲瓚在555 nm的吸光度(OD555 nm)為計(jì)數(shù)依據(jù)，活菌數(shù)的對數(shù)(LgC)與LgOD555 nm線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9965，線性檢測范圍為7.8×106~2.5×108 CFU/ml；ATP生物發(fā)光法以ATP產(chǎn)生的相對發(fā)光度值(RLU)為計(jì)數(shù)依據(jù)，LgC與LgRUL線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，線性檢測范圍為1.0×104~3.0×108 CFU/ml；高通量生長曲線法以生長曲線達(dá)到拐點(diǎn)的時(shí)間(Ts)為計(jì)數(shù)依據(jù)，LgC與Ts線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為LgC=-(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，線性檢測范圍為1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3種方法對實(shí)際菌液測量并與平板計(jì)數(shù)法比較表明，ATP生物發(fā)光法與高通量生長曲線法有很好的準(zhǔn)確性，MTT比色法準(zhǔn)確度稍差，而高通量生長曲線法有最寬的線性范圍，也最適合高通量測定。
細(xì)菌計(jì)數(shù)方法是微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，主要分為直接計(jì)數(shù)法和間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。直接計(jì)數(shù)法主要有顯微鏡觀察法(包括光學(xué)顯微鏡技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)等)和比濁計(jì)數(shù)法等；間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法主要有平板菌落計(jì)數(shù)法(包括傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法、微菌落技術(shù)等)和最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法(Most probable number，MPN法，也稱為稀釋培養(yǎng)法)等(王婷婷等,2008)。傳統(tǒng)的直接計(jì)數(shù)法不能區(qū)分細(xì)菌的死活，且靈敏度低、線性范圍狹窄，間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法雖然能確定活菌數(shù)量，但工作量大，難以對大批量樣品進(jìn)行同時(shí)操作。例如，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中的菌群計(jì)數(shù)法采用MPN法和平板計(jì)數(shù)法(GB 4789.3-2010)，這2種方法都需要培養(yǎng)24~48 h，且工作量大、檢測線性范圍窄，難以進(jìn)行快速、大批量的檢測工作，MPN法的精確性還存在疑問；為了簡化檢測程序、縮短檢測時(shí)間，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的快速檢測方法的研究，提出了電阻抗檢測法、Sim PlateTM全平皿計(jì)數(shù)法、微菌落技術(shù)、最大或然數(shù)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)計(jì)數(shù)法(MPN-PCR法)、流式細(xì)胞儀測定法等檢測方法，取得了一定的成果，但也存在不同的缺陷和不足。例如，流式細(xì)胞儀測定法雖然靈敏度、簡便性都有了較大的提升，但由于其成本昂貴，且不能區(qū)分細(xì)菌的死活，在實(shí)際應(yīng)用中受到了很大的制約。
MTT是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，能穿過細(xì)胞膜被活細(xì)胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶還原，形成藍(lán)紫色不溶于水的甲瓚(Formazan)(Mosmann,1983)，死細(xì)胞酶活性喪失而沒有顏色反應(yīng)。用有機(jī)溶劑溶解甲瓚后(邊興艷,1998)，測定溶液的吸光度(OD值)而確定活細(xì)胞數(shù)(Gerlier et al,1986)。該法快速、經(jīng)濟(jì)、操作相對簡便、重復(fù)性較好，近年來被廣泛應(yīng)用到大腸桿菌(Escherichia coli)(王栩等,2002)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)(黃立坤等,2008)、伴放線菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)(王忠朝等,2010)和酵母菌(龔加路等,2016)等的活菌計(jì)數(shù)中。
三磷酸腺苷(ATP)是所有生命活動(dòng)的能量載體(Velten et al,2007)，活細(xì)菌中ATP含量會(huì)維持在一定范圍，細(xì)菌死亡后ATP會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被細(xì)胞內(nèi)酶所分解(Holm-Hansen et al,1966)，樣品中ATP含量即可間接反映活細(xì)菌數(shù)量。ATP生物發(fā)光法(Miller et al,1992;Selan et al,1992;Nyrén,1994;McElroy et al,1949)是熒光素酶在Mg2+條件下催化熒光素與ATP反應(yīng)形成熒光素-AMP的復(fù)合物，與O2結(jié)合時(shí)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度呈線性關(guān)系，從而檢測活菌的數(shù)量(Moyer et al,1983;Gr?nroos et al,1983)。ATP生物發(fā)光法操作簡便，能快速得到結(jié)果，與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相比，不僅能區(qū)分細(xì)菌的死活，而且還能檢測出不可培養(yǎng)的微生物(Hammes et al,2010)。
借鑒實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線原理，利用微生物類似于PCR擴(kuò)增的指數(shù)生長曲線(Brewster,2003)，建立了高通量生長曲線法，該法與傳統(tǒng)的MPN法完全不同，是根據(jù)細(xì)菌生長達(dá)到特定濁度的時(shí)間進(jìn)行活菌的計(jì)數(shù)，在微孔板的微量培養(yǎng)體積上，設(shè)置多個(gè)平行，以高通量的方式對微生物的生長進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，達(dá)到類似實(shí)時(shí)定量PCR那樣在極寬的線性范圍進(jìn)行微生物的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的效果。在上述背景下，本研究對MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長曲線法進(jìn)行了比較。
相關(guān)新聞推薦
1、轉(zhuǎn)錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達(dá)調(diào)控——?討論與結(jié)論
2、空腸彎曲菌噬菌體生物學(xué)特性測定及生長曲線繪制（一）
3、鼠疫桿菌菌株在麥芽糖培養(yǎng)基環(huán)境下對應(yīng)的生長曲線圖
4、冷鮮豬肉中熱殺索絲菌生長動(dòng)力學(xué)模型和貨架期預(yù)測模型構(gòu)建——結(jié)果與分析、結(jié)論