內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)白色念珠菌生長抑制和生物膜形成的影響（三）
3.4、LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜通透性和完整性的影響
使用CLSM進(jìn)一步觀察和評(píng)估LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響。細(xì)胞膜完整的白色念珠菌細(xì)胞染色后呈綠色熒光，細(xì)胞膜受損后染色呈紅色熒光。圖3展示了未處理組和LSL處理2、4、12 h后白色念珠菌細(xì)胞膜完整性的變化?？梢园l(fā)現(xiàn)，未處理的細(xì)胞呈明亮的綠色熒光，表明真菌細(xì)胞膜完整性良好(圖3A),而LSL處理后,紅綠熒光比率隨時(shí)間延長呈非線性增加,處理4h后視野中基本均為紅色熒光,表明真菌細(xì)胞膜的完整性被LSL逐步破壞(圖3B-D)。由此可知,LSL能夠通過改變白色念珠菌細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜的完整性，使其無法維持正常的生命活動(dòng)實(shí)現(xiàn)抑菌和殺菌目的。
3.5、LSL對(duì)白色念珠菌胞內(nèi)ATP含量的影響
通過測定胞內(nèi)ATP含量的變化考察LSL對(duì)白色念珠菌能量代謝的影響。如圖4所示，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，LSL處理組的ATP含量始終顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，提示處理組細(xì)胞ATP的合成一直處于被抑制狀態(tài)。其中，0~2h內(nèi)兩者差距倍數(shù)最大，這可能與作用初期部分白色念珠菌細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞膜通透性的改變導(dǎo)致的胞內(nèi)ATP的快速流失有關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，未處理組胞內(nèi)ATP含量呈持續(xù)增加趨勢，LSL處理組胞內(nèi)ATP含量呈先增大后減小趨勢，均與其生長曲線保持一致。可以推斷，在處理濃度為MIC的LSL作用下，雖然白色念珠菌細(xì)胞的能量代謝被抑制，細(xì)胞供能不足，影響了細(xì)胞的生理代謝，導(dǎo)致了部分細(xì)胞生長停滯甚至死亡，但仍有大量細(xì)胞存活，這一結(jié)果與上述顯微鏡觀察結(jié)果一致。
3.6、LSL對(duì)白色念珠菌胞外紫外吸收物質(zhì)濃度的影響
通過測定LSL對(duì)白色念珠菌胞外核酸和蛋白質(zhì)等紫外吸收物質(zhì)含量的影響,進(jìn)一步確定其對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用。如圖5所示,在整個(gè)培養(yǎng)過程中,LSL處理組的OD260在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于未處理對(duì)照組(P<0.05)。LSL處理組胞外紫外吸收物質(zhì)含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長持續(xù)增長,與此同時(shí),未處理對(duì)照組胞外紫外吸收物質(zhì)則一直保持較低水平,且兩者的差距隨時(shí)間的延長逐漸擴(kuò)大。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，LSL破壞了白色念珠菌細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)外流，而正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞膜完整程度高，胞內(nèi)物質(zhì)流出比例較低。
3.7、LSL對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響
在微孔板中培養(yǎng)生物膜，使用結(jié)晶紫染色法考察LSL對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響，結(jié)果如圖6所示。與對(duì)照組相比，不同濃度LSL處理后，最終白色念珠菌生物膜形成量減少了65.2%~97.0%，說明低濃度的LSL即可有效抑制白色念珠菌生物膜的形成(P<0.05)。此外，LSL對(duì)生物膜形成的破壞作用與其劑量呈正相關(guān)，LSL濃度越高，抑制效果越強(qiáng)。在MIC濃度的LSL作用下,生物膜的形成下降了86.6%,這可能還與LSL導(dǎo)致白色念珠菌細(xì)胞受損或不能生存,無法形成生物膜有關(guān)。
4、討論
生物表面活性劑一直被認(rèn)為是可用于環(huán)境和生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的，具有潛在應(yīng)用價(jià)值的物質(zhì)。近年來，生物表面活性劑在醫(yī)療保健相關(guān)中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注，大量研究表明，生物表面活性劑具有廣泛的抗菌和抗黏附活性，其主要通過防止微生物黏附在固體表面來抑制、控制或破壞生物膜的形成。
SLs是一類最具應(yīng)用潛力的生物表面活性劑,已表現(xiàn)出優(yōu)秀的表面活性劑和廣泛的抗菌活性。在抗細(xì)菌方面,Kim等研究發(fā)現(xiàn),30μg/mL的SLs可以抑制大腸埃希菌的生長，但Ma等的研究發(fā)現(xiàn)，LSL對(duì)金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌均有顯著的生長抑制效應(yīng),MIC值分別為0.05mg/mL和4.00 mg/mL,但對(duì)大腸埃希菌和乳桿菌的抑制作用較差。Lydon等報(bào)道20 mg/mL的ASL對(duì)糞腸球菌和銅綠假單胞菌具有抗菌作用,但大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為ASL不具備抑菌活性。在抗細(xì)菌生物膜形成方面,Diaz De Rienzo等研究發(fā)現(xiàn),5%的SL能夠破壞枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌培養(yǎng)和混合培養(yǎng)形成的生物膜。Seena等的研究發(fā)現(xiàn)，基于ASL和抗菌肽的制劑可以用作金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抗菌劑和抗菌生物膜劑。在抗真菌方面，SLs被報(bào)道能夠抑制植物源致病真菌水稻紋枯菌、水稻稻瘟菌和馬鈴薯晚疫病菌孢子的萌發(fā)以及菌絲的生長。LSL還被報(bào)道具有抑制紅色毛癬菌、犬小孢子菌、馬拉色菌等皮膚致病性真菌生長和菌絲蔓延的作用。
機(jī)會(huì)性致病真菌白色念珠菌是真菌相關(guān)院內(nèi)感染的主要原因之一，其感染范圍從淺表到全身。當(dāng)外界環(huán)境或人體免疫系統(tǒng)發(fā)生改變時(shí)，白色念珠菌可以快速增殖并形成生物膜，侵襲機(jī)體細(xì)胞、組織，造成黏膜和真皮感染。臨床研究表明，白色念珠菌等微生物可以以生物膜的形式黏附于創(chuàng)口或者醫(yī)療器械表面，引起機(jī)體的持續(xù)性感染。
目前已有少量有關(guān)SLs對(duì)白色念珠菌浮游細(xì)胞的抗真菌活性及生物膜活性的報(bào)道。如Dengle-Pulate等研究表明，以月桂醇為底物制備的SLs有抗白色念珠菌浮游細(xì)胞生長作用，5.00mg/mL的SLs的抑制率為30%;細(xì)胞微觀形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)未處理組細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)含物完整，處理組出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)體積增加等現(xiàn)象。Haque等的研究發(fā)現(xiàn)，濃度為0.48 mg/mL的LSL即可抑制80%的白色念珠菌生物膜的形成，并降低預(yù)制生物膜的活力;且LSL與兩性霉素B或氟康唑的聯(lián)用對(duì)破壞生物膜的形成和預(yù)形成的生物膜有協(xié)同作用。
雖然上述文獻(xiàn)以及前期實(shí)驗(yàn)室研究已確定了SLs的抗菌活性及抗生物膜作用，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，SLs的結(jié)構(gòu)和來源，被處理菌株的細(xì)胞形態(tài)、SLs的濃度及作用時(shí)間等的不同均會(huì)影響SLs的抑菌效果，給SLs的臨床應(yīng)用帶來困擾?；诖?，本研究以白色念珠菌浮游細(xì)胞和生物膜為研究對(duì)象，從濃度和作用時(shí)間兩個(gè)維度，系統(tǒng)評(píng)價(jià)和探討LSL對(duì)其生長和生物膜形成的抑制作用和抑制機(jī)制，評(píng)估LSL在抗菌藥物開發(fā)中的潛在用途，為臨床治療白色念珠菌引起的相關(guān)疾病提供參考。
在本研究中，LSL對(duì)白色念珠菌的MIC和MFC分別為6.00mg/mL和18.00mg/mL，提示LSL對(duì)白色念珠菌的抑制效果優(yōu)于已報(bào)道的以月桂醇為底物制備所得SLs的抗白色念珠菌活性。LSL對(duì)白色念珠菌的時(shí)間-抑菌曲線顯示，LSL對(duì)白色念珠菌的動(dòng)態(tài)抑制效果顯著且快速，所有處理組在2h內(nèi)基本均可達(dá)到最大抑菌率，且抑制作用具有長效性。生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LSL可以顯著抑制白色念珠菌生物膜的形成，生物膜抑制率與其劑量呈非線性正相關(guān)；2.00 mg/mL的LSL即可抑制65.2%的白色念珠菌生物膜的形成，當(dāng)LSL濃度為MIC時(shí)，生物膜形成量下降了86.6%，這一結(jié)果與上述Haque等所報(bào)道的0.48 mg/mL的LSL即可抑制80%的白色念珠菌生物膜的形成差異較大。
目前常用抗真菌藥物的抑菌作用主要與其對(duì)真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞內(nèi)外酶活性和能量代謝的影響等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過SEM觀察菌體超微形態(tài)，CLSM檢測處理前后細(xì)胞膜通透性變化，測定胞內(nèi)ATP和胞外紫外吸收物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)：
1.LSL處理后的白色念珠菌細(xì)胞表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，菌體細(xì)胞壁表面出現(xiàn)凹陷、皺縮和塌陷現(xiàn)象，部分菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞膜被連續(xù)性破壞并出現(xiàn)“爆破”現(xiàn)象；
2.LSL處理后的CLSM視野基本均為紅色熒光，提示白色念珠菌細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，完整性被破壞，細(xì)胞逐步死亡；
3.LSL處理后的白色念珠菌胞內(nèi)ATP含量顯著降低，胞外紫外吸收物質(zhì)含量顯著升高，提示菌體胞內(nèi)小分子及紫外吸收大分子物質(zhì)發(fā)生泄漏。
由此推測，LSL可能通過以下機(jī)制發(fā)揮抑菌作用：
1.雙親性分子LSL具備的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)通過改變白色念珠菌菌體細(xì)胞膜的通透性，使更多的LSL穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，之后與細(xì)胞內(nèi)參與合成細(xì)胞壁的物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而影響菌體細(xì)胞壁的合成；
2.LSL進(jìn)入細(xì)胞壁后，通過與細(xì)胞膜的磷脂層相互作用形成孔洞進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性；
3.細(xì)胞膜通透性和完整性發(fā)生改變，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如小分子物質(zhì)、離子、ATP、核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生外泄，影響菌體細(xì)胞正常新陳代謝系統(tǒng)；
4.細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等細(xì)胞器的破壞干擾了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)的合成與表達(dá)，使細(xì)胞不能合成正常的蛋白質(zhì)，從而引起細(xì)胞物質(zhì)、能量和信息的傳遞中斷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
研究已確定白色念珠菌在形成生物膜后對(duì)抗真菌藥物的耐受性會(huì)大幅提高，生物膜抗藥能力的增強(qiáng)與影響細(xì)胞初始黏附過程、形成微菌落、細(xì)胞外基質(zhì)阻止藥物滲透等多種因素有關(guān)。本研究結(jié)果表明，低于MIC的亞抑制濃度的LSL即可以有效阻止初始細(xì)胞在非生物表面上的附著，進(jìn)而減少白色念珠菌形成生物膜的數(shù)量。此外，LSL誘導(dǎo)的白色念珠菌細(xì)胞受損或死亡也使白色念珠菌無法形成成熟的生物膜。因此，抑制初始細(xì)胞的黏附和誘導(dǎo)細(xì)胞受損并脫離可能是對(duì)抗生物膜相關(guān)感染的有效策略。
結(jié)論
綜上所述，LSL能夠有效抑制白色念珠菌浮游細(xì)胞的生長和生物膜的形成，這種作用主要通過影響細(xì)胞壁的合成，提高細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜的完整性，引起胞內(nèi)ATP、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)外泄，以及有效阻止初始細(xì)胞的黏附和誘導(dǎo)生物膜的分散和脫離實(shí)現(xiàn)。上述研究結(jié)果可為開發(fā)基于LSL的抗真菌制劑或佐劑，用于治療由白色念珠菌引起的真菌感染提供一定的參考和借鑒。然而，LSL作用后白色念珠菌細(xì)胞在分子層面上發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能變化，以及細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)及遺傳信息表達(dá)是否受到干擾等相關(guān)的研究尚不明確，仍需進(jìn)一步探究和驗(yàn)證。
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