內(nèi)酯型槐糖脂對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)抑制和生物膜形成的影響（二）
2.3LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響
使用SEM觀察LSL處理不同時(shí)間后白色念珠菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化。處理組取培養(yǎng)好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期白色念珠菌菌液(菌濃已調(diào)整為1 x106CFU/mL)，以2.0%(v/v)接種量將其接種到LSL濃度為MIC值的50mL液體培養(yǎng)基中,對(duì)照組取上述白色念珠菌菌液接種于等體積未添加LSL的液體培養(yǎng)基中。分別在培養(yǎng)2、4、8、12h時(shí)各取出3 mL培養(yǎng)物于6000r/min(離心半徑9.25cm)離心10 min收集菌泥，PBS溶液洗滌3次后使用2.5%戊二醛在4℃冰箱中固定12h,PBS溶液洗滌3次后離心并分別以乙醇梯度脫水(50%，70%，80%，90%，100%)，真空條件下干燥，噴金，SEM觀察并拍照。
2.4LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜通透性和完整性的影響
使用CLSM觀察LSL處理前后白色念珠菌細(xì)胞膜通透性和完整性的變化。使用熒光探針羧基熒光素雙乙酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)標(biāo)記和區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。分別在培養(yǎng)2、4和12h時(shí)取按2.3步驟制備的處理組和對(duì)照組細(xì)菌懸液各500μL,4℃下6000r/min離心10min后收集菌體，等體積PBS溶液重懸后加入cFDA使其終濃度為100μmol/L,避光反應(yīng)10min后加入PI使其終濃度為30μmol/L,避光反應(yīng)10min后10000r/min離心2min收集菌體，PBS溶液重復(fù)洗滌3次，最終將菌體懸浮于500μL PBS中。吸取3.0μL菌液置于CLSM下觀察并拍照。
2.5LSL對(duì)白色念珠菌胞內(nèi)ATP含量的影響
通過(guò)測(cè)定胞內(nèi)ATP濃度的變化，分析LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響。按2.3步驟制備處理組和對(duì)照組細(xì)菌懸液,分別在培養(yǎng)不同時(shí)間后取樣,將上述樣品在10000r/min下離心1min后分別收集菌體和上清液置于冰上備用。取菌體按照ATP測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)處理樣品并測(cè)定和計(jì)算樣品胞內(nèi)ATP含量。每組測(cè)定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次測(cè)定設(shè)置3個(gè)平行。
2.6LSL對(duì)白色念珠菌胞外紫外吸收物質(zhì)含量的影響
取2.5中制備所得上清液樣品,使用酶標(biāo)儀分別測(cè)定其在波長(zhǎng)為260nm下的吸光度值,評(píng)估LSL處理不同時(shí)間后白色念珠菌胞外紫外吸收物質(zhì)(主要為核酸和蛋白質(zhì)等)濃度的變化。
2.7 LSL對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響
采用結(jié)晶紫染色法評(píng)估LSL對(duì)白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。取100mu L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌菌液(菌濃調(diào)整為1x106CFU/mL)與等體積LSL溶液混合,使LSL終濃度為0~20mg/mL。37℃下共孵育24h后將液體輕輕吸出，使用PBS溶液清洗3次以去除浮游細(xì)胞,其余貼壁細(xì)胞使用99%甲醇固定15 min,之后將甲醇吸出并靜置,待甲醇完全揮發(fā)后加人100μL0.1%結(jié)晶紫染色5min。染色結(jié)束后將染液吸出并使用PBS清洗3次,最后加入100μL 95%乙醇溶解細(xì)胞中結(jié)合的結(jié)晶紫。以未經(jīng)LSL處理菌液為對(duì)照組，以波長(zhǎng)600nm處測(cè)定的吸光度為生物膜質(zhì)量的量度,參照生物膜抑制率公式計(jì)算LSL對(duì)白色念珠菌的生物膜抑制率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。生物膜抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A600÷對(duì)照組A600)]x 100%。
2.8數(shù)據(jù)處理與分析
采用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3、結(jié)果
3.1、LSL對(duì)白色念珠菌MIC和MFC
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)LSL濃度為6.00mg/mL時(shí)，最終菌液與初始菌液的A_{600}差值穩(wěn)定在5%以?xún)?nèi);當(dāng)LSL濃度為18.00 mg/mL時(shí),平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。因此，LSL對(duì)白色念珠菌的MIC為6.00mg/mL，MFC為18.00mg/mL。如無(wú)特殊說(shuō)明,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所使用的LSL處理濃度均為L(zhǎng)SL對(duì)白色念珠菌的MIC值。
3.2、LSL對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響
圖1為以12h為一生長(zhǎng)周期繪制所得的LSL對(duì)白色念珠菌浮游細(xì)胞的時(shí)間-抑菌率變化曲線。可以發(fā)現(xiàn)，LSL對(duì)白色念珠菌浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)快速且顯著，且抑制效果隨LSL濃度的增加而提升。其中,0~2h內(nèi)的抑菌率增速最快,2h后8.00mg/mL的LSL即可發(fā)揮穩(wěn)定的抑菌效果;當(dāng)濃度高于8.00 mg/mL時(shí),LSL還表現(xiàn)出明顯的殺菌和溶菌作用,此結(jié)果與LSL對(duì)白色念珠菌的MIC和MFC測(cè)定結(jié)果一致。
3.3、LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響
使用SEM考察LSL對(duì)白色念珠菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響。最小抑菌濃度的LSL與白色念珠菌相互作用2、4、8、12h后的菌體微觀形態(tài)如圖2所示。未經(jīng)LSL處理的空白對(duì)照菌體表面光滑，形態(tài)完整且飽滿，細(xì)胞壁邊緣清晰，界限明顯，菌體呈橢球狀形態(tài)(圖2A);LSL處理2h后大部分菌體形態(tài)完整，少量細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)在菌體出現(xiàn)凹陷、皺縮和塌陷現(xiàn)象，部分內(nèi)容物外泄(圖2B);LSL處理4h后菌體皺縮現(xiàn)象更加明顯，少量菌體出現(xiàn)破損現(xiàn)象(圖2C);LSL處理8h后，部分細(xì)胞失去完整形態(tài)，菌體破損嚴(yán)重呈“爆破”狀，且內(nèi)容物外泄產(chǎn)生的粘性使破損細(xì)胞聚集在一起，細(xì)胞間界限不再明顯(圖2D);LSL處理12h后，所有細(xì)胞均變形且嚴(yán)重破損，菌體因被部分溶解而黏連在一起聚集成團(tuán)(圖2E)。LSL處理不同時(shí)間后白色念珠菌細(xì)胞的微觀形態(tài)變化表明，LSL具有很強(qiáng)的群體生長(zhǎng)抑制作用，菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性均遭到了不同程度的破壞。
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