內(nèi)酯型槐糖脂對白色念珠菌生長抑制和生物膜形成的影響（一）
[摘要]目的考察和探討內(nèi)酯型槐糖脂(Lactonicsophorolipid,LSL)對白色念珠菌的浮游細(xì)胞生長和生物膜形成的影響及機(jī)制。方法以白色念珠菌為受試菌，采用微量稀釋法和平板涂布法測定LSL對白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MFC);利用吸光光度法測定LSL對白色念珠菌浮游細(xì)胞生長的影響并繪制抑菌曲線;通過結(jié)晶紫染色法測定LSL對白色念珠菌生物膜形成的影響。采用掃描電鏡(SEM)觀察LSL對菌體超微形態(tài)影響;激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)檢測處理前后細(xì)胞膜通透性變化;試劑盒檢測胞內(nèi)ATP和胞外紫外吸收物質(zhì)含量變化。結(jié)果LSL對白色念珠菌的MIC值為6.00mg/mL,MFC值為18.00mg/mL。抑菌曲線顯示LSL對白色念珠菌浮游細(xì)胞的抑制效果顯著、快速且長效，所有處理組在2h內(nèi)均可達(dá)到最大抑菌率。低濃度的LSL即可顯著抑制白色念珠菌生物膜的形成。LSL抑制白色念珠菌生長和破壞生物膜形成的效果均與其劑量呈非線性正相關(guān)。LSL處理組細(xì)胞的細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞膜通透性發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的破損和死亡現(xiàn)象，同時胞內(nèi)ATP流失嚴(yán)重，胞外紫外吸收物質(zhì)含量顯著上升。結(jié)論LSL能夠有效抑制白色念珠菌的生長和形成生物膜，具備被開發(fā)為抗菌劑或者佐劑用于治療白色念珠菌引起的相關(guān)疾病的潛力。
白色念珠菌(Candida albicans)，又稱白假絲酵母菌，是一種機(jī)會性致病真菌，主要存在于人類胃腸道和泌尿生殖道中。該真菌的過度生長與包括鵝口瘡、陰道念珠菌病等在內(nèi)的多種疾病相關(guān)，近年來還發(fā)現(xiàn)該菌與炎癥性腸病、胃腸道癌等疾病息息相關(guān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，免疫缺陷和免疫功能低下的患者以及攜帶醫(yī)療植入裝置的患者更易感染念珠菌。目前，主要使用抗真菌藥物進(jìn)行白色念珠菌感染的治療，但由于延遲診斷和白色念珠菌產(chǎn)生耐藥性等原因，念珠菌病在世界范圍內(nèi)與高死亡率相關(guān)聯(lián)。
生物膜是指附著于有生命或無生命物體表面被微生物胞外大分子包裹的有組織的細(xì)胞群體。不同于浮游細(xì)胞，以生物被膜形式存在的細(xì)胞對殺菌劑、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機(jī)制具有更強(qiáng)的抗性。如白色念珠菌生物膜對抗真菌藥物的抵御能力是浮游細(xì)胞的10~1000倍，極大增加了相關(guān)疾病治療的難度和風(fēng)險。因此，迫切需要開發(fā)能夠單獨(dú)使用或與目前抗真菌藥物聯(lián)合使用的新型抗真菌藥物，以有效對抗白色念珠菌浮游細(xì)胞和生物膜，降低白色念珠菌耐藥性和應(yīng)對持續(xù)性感染。
近年來，具有廣泛抗菌和抗黏附活性的生物表面活性劑在醫(yī)療保健中的研究和使用越來越被關(guān)注，槐糖脂(Sophorolipids，SLs)是一類主要由球擬假絲酵母(Starmerella bombicola)等發(fā)酵產(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑，其在制藥和食品行業(yè)的應(yīng)用已獲美國FDA批準(zhǔn)。天然合成的SLs是內(nèi)酯型(Lactonic Sophorolipid，LSL)和酸型(Acidic Sophorolipid,ASL)的混合物,其中,LSL具有更優(yōu)秀的抗菌活性和抗腫瘤特性。SLs對某些致病性細(xì)菌和真菌的抗菌活性已被報(bào)道,但LSL對白色念珠菌浮游細(xì)胞和生物膜形成的抑制作用及抑制機(jī)制還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。本研究旨在考察LSL對白色念珠菌浮游細(xì)胞和生物膜形成的影響，同時探討LSL介導(dǎo)的白色念珠菌生長抑制和生物膜抑制機(jī)制，以期為白色念珠菌引起的相關(guān)疾病的臨床治療提供參考。
1、材料與方法
1.1菌株白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231)，購于美國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心(ATCC)，現(xiàn)保存于實(shí)驗(yàn)室。
1.2主要試劑內(nèi)酯型槐糖脂(LSL)由實(shí)驗(yàn)室使用熊峰生假絲酵母(Starmerella bombicola)以葡萄糖和菜籽油為底物發(fā)酵后經(jīng)分離純化獲得，產(chǎn)品純度為95%;沙氏培養(yǎng)基購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;羧基熒光素雙乙酸酯(cFDA)、碘化丙啶(PI)、1.0%結(jié)晶紫染料、BC0300 ATP測定試劑盒購自北京Solarbio科技有限公司。
1.3主要儀器設(shè)備UV759CRT紫外-可見分光光度計(jì)購于上海佑科儀器儀表有限公司;HX-10N-50B真空冷凍干燥機(jī)購于上海滬析實(shí)業(yè)有限公司;3K30冷凍高速離心機(jī)購于德國Sigma公司;GeminiSEM 450場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)和FV1000激光共聚焦顯微鏡(CLSM)均購于德國蔡司公司;318C酶標(biāo)儀購于上海沛歐分析儀器有限公司。
2方法
2.1LSL對白色念珠菌MIC和MFC的測定
使用液體沙氏培養(yǎng)基溶解LSL，制備不同濃度的LSL溶液。取100μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的白色念珠菌菌液（菌濃調(diào)整為1×10? CFU/mL）與等體積LSL溶液混合，使LSL終濃度梯度為0~20 mg/mL。將混合液分別加入Biosense系統(tǒng)專用孔板中，設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)為37℃連續(xù)培養(yǎng)12 h，并啟動自動光學(xué)監(jiān)測模塊（檢測波長600 nm），實(shí)時記錄菌液吸光度（A???）的動態(tài)變化。當(dāng)某一濃度下的菌液生長曲線進(jìn)入平臺期且吸光度變化率持續(xù)低于5%時，系統(tǒng)自動判定該濃度為LSL對白色念珠菌的MIC。分別取大于MIC濃度的各LSL-菌液混合液100μL，涂布于固體沙氏培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。以無菌落生長的平板對應(yīng)的最低LSL濃度作為LSL對白色念珠菌的MFC。每組測定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次測定設(shè)置3個平行樣本。
2.2LSL對白色念珠菌生長的影響
以抑菌率(%)為指標(biāo)考察LSL對白色念珠菌的生長抑制作用。配制含不同濃度LSL的液體沙氏培養(yǎng)基,滅菌后按2.0%(v/v)的接種量將已活化至對數(shù)生長期的白色念珠菌(菌濃已調(diào)整為1x106CFU/mL)接種至不同培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)12h(37℃,200rpm),每組重復(fù)3次并設(shè)未添加LSL的陰性對照組以及未接種的空白培養(yǎng)基對照組。每隔2h分別吸取培養(yǎng)物200μL于96孔板中測定A600，根據(jù)抑菌率計(jì)算公式計(jì)算抑菌率并繪制時間-抑菌率曲線。抑菌率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A_{600^{-}}空白組A_{600})÷(陰性組A_{600^{-}}空白組A_{600})]X 100%。
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