厭氧微生物生孢梭菌生長所需的最低水分活度（Aw）【試驗】
水分活度（Aw）是評價食品和化妝品微生物風(fēng)險和產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要依據(jù)，在藥品微生物控制中，Aw測定已有一定應(yīng)用前景。Aw與微生物的生長密切相關(guān)，微生物又是反映藥品安全性和有效性的重要指標(biāo)，大多數(shù)細(xì)菌在Aw低于0.91時停止生長，大多數(shù)霉菌在Aw低于0.80時停止生長。通過測定Aw，可更好地反映藥品質(zhì)量，且該測定無破壞性，省時省力，設(shè)備簡單價廉，對于制藥產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)環(huán)境控制、包裝材料選擇與藥品成品保存等都有重要意義。一些與制藥相關(guān)的代表性微生物生長所需的最低Aw，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門氏菌在水分活度低于0.91的產(chǎn)品中不會增殖或存活，革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌在Aw低于0.86時不會增殖，黑曲霉在Aw低于0.77時不會增殖。但與制藥相關(guān)的厭氧菌株由于生長條件嚴(yán)苛，其生長所需最低Aw研究較少。
生孢梭菌為厭氧微生物的代表，為梭狀芽孢桿菌屬，噬菌體約為1μm×5μm的革蘭陽性桿菌，該菌未收錄于《美國藥典》1112的微生物生長所需的最低Aw，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)未找到其生長的最低Aw，因此目前無參考的最低Aw。本研究中參考《美國藥典》1112收錄肉毒梭菌生長所需最低Aw（0.95），將培養(yǎng)基的Aw調(diào)至0.90～0.99，進行預(yù)試驗及正式試驗?，F(xiàn)報道如下。
1材料與方法
1.1材料
菌種：生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。
試劑：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（-批號為180830），梭菌增菌培養(yǎng)基（批號為170701），哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（批號為170717），均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。丙三醇（批號為20180730），氯化鈉（批號為20180509）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蔗糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號為20170510）。
儀器：Aqualab4TE型水分活度儀（美國Decagon公司）；HFSAFE1200LC型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；SX-500型蒸汽滅菌器（YOMY）；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PL202-S型電子天平（瑞士梅特勒公司，d=0.01 g）；厭氧產(chǎn)氣包（Mitsubishhi Gas Chemical CO.，INC.批號為8089ZJ-1）。
1.2方法
梭菌增菌培養(yǎng)基配制：分別用氯化鈉、蔗糖、丙三醇調(diào)節(jié)梭菌增菌培養(yǎng)基，滅菌后測量Aw，使其Aw值為0.90～0.98，同時配制不調(diào)Aw的梭菌增菌培養(yǎng)基，作為T0。
菌液制備：開啟生孢梭菌菌種，將3代微球菌轉(zhuǎn)接至12 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋成每1mL含104cfu菌落數(shù)的菌懸液。
接種：取制備好的新鮮菌懸液0.3 mL，加入上述梭菌增菌培養(yǎng)基30 mL中，混勻，其中T0為對照組，其余均為試驗組。
培養(yǎng)：將各組試驗管置厭氧培養(yǎng)袋中，35℃培養(yǎng)，分別于0，4，6，18，24，48，72，96，120 h時間點，取1 mL稀釋至適宜的稀釋級接種平皿（直徑90 mm），注入溫度不超過45℃哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基約20 mL，待培養(yǎng)基凝固后裝入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋，于35℃厭氧培養(yǎng)72 h，計數(shù)。
繪制生長速率曲線：不同介質(zhì)在獲得生孢梭菌生長所需最低Aw后，選擇最低Aw T附近的3個水平，即低于Aw限值0.01單位TL，高于Aw限值0.01單位TH分別進行重復(fù)3次試驗，以測得的菌落數(shù)（cfu）的對數(shù)值，對時間（h）作圖，繪制生長速率曲線。
2結(jié)果
2.1氯化鈉培養(yǎng)介質(zhì)下生孢梭菌所需最低Aw
以氯化鈉調(diào)節(jié)梭菌增菌培養(yǎng)基Aw，測定在4種不同Aw（0.94，0.95，0.96，0.97）下生孢梭菌的生長速率。3次重復(fù)試驗結(jié)果均顯示，Aw值為0.94時，生孢梭菌不生長；比較3次試驗結(jié)果，第3次試驗結(jié)果顯示，Aw值為0.95時，生孢梭菌出現(xiàn)緩慢生長跡象（圖1）；Aw≥0.96時，生孢梭菌可正常生長?？梢姡月然c調(diào)節(jié)梭菌增菌液的Aw，生孢梭菌生長所需的最低Aw范圍為0.95～0.96。另外，由生長速率曲線可見，生孢梭菌一般在培養(yǎng)24 h后進入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)48 h后可達(dá)到生長穩(wěn)定期。
2.2蔗糖培養(yǎng)介質(zhì)下生孢梭菌所需最低Aw
以蔗糖調(diào)節(jié)梭菌增菌培養(yǎng)基Aw，測定在4種不同Aw（0.94，0.95，0.96，0.99）下生孢梭菌的生長速率。3次重復(fù)試驗結(jié)果均顯示，Aw為0.94時，生孢梭菌不生長（圖2）；Aw為0.95時，生孢梭菌出現(xiàn)緩慢生長跡象；Aw≥0.96時，生孢梭菌可正常生長。可見，以蔗糖調(diào)節(jié)梭菌增菌液的Aw，生孢梭菌生長所需的最低Aw范圍為0.95～0.96。
2.3甘油培養(yǎng)介質(zhì)下生孢梭菌所需最低Aw
以甘油調(diào)節(jié)梭菌增菌培養(yǎng)基Aw，測定在3種不同Aw（0.91，0.92，0.93）下生孢梭菌的生長速率。3次重復(fù)試驗結(jié)果均顯示，Aw為0.91時，生孢梭菌不生長（圖3）；Aw≥0.92時，生孢梭菌可正常生長?？梢?，以甘油調(diào)節(jié)梭菌增菌液的水分活度，生孢梭菌生長所需的最低Aw為0.92。
3討論
生孢梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，菌齡、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件對試驗結(jié)果的影響非常大，每次試驗都必須制備新鮮菌種，保證菌齡及菌的活性；梭菌增菌液培養(yǎng)基主要是瓊脂和半胱氨酸，起到保證培養(yǎng)基體系厭氧環(huán)境的作用，隨著時間的增長，體系的還原物質(zhì)會被消耗，這使得0 h剛加入的菌的存活率受到威脅，故每次試驗都必須采用新鮮配制的培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件采用厭氧培養(yǎng)袋，每個時間節(jié)點進行計數(shù)的同時，對厭氧環(huán)境有更高要求，也會對試驗結(jié)果的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，針對該項問題，快速試驗，盡可能每個時間點重新放置厭氧產(chǎn)氣袋，保證厭氧培養(yǎng)條件；不同的介質(zhì)，生孢梭菌生長所需最低Aw不同，其中甘油的試驗結(jié)果相對穩(wěn)定，生孢梭菌生長所需最低Aw最低，尤其在0 h時，同樣的接菌量，甘油測得的菌落數(shù)常高于蔗糖和氯化鈉，有時甚至高于對照組，甘油本身有助于厭氧條件的保存。
圖3甘油培養(yǎng)介質(zhì)下生孢梭菌生長所需最低水分活度
2015年版《中國藥典（四部）》中，生孢梭菌在陰道、尿道及固體局部給予非無菌制劑中被列為控制菌，故本研究對于制藥產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)環(huán)境控制、包裝材料選擇及藥品成品貯存及日常微生物限度檢查均有價值。與在制藥工業(yè)中廣泛采用的水含量的物理意義相比，Aw更有助于理解制藥產(chǎn)品的相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)內(nèi)涵?！睹绹幍洹贰稓W洲藥典》已意識到了Aw及其應(yīng)用的重要性，先后推出了Aw規(guī)定。故建議建立合理微生物相關(guān)Aw控制策略，從而進一步推動我國微生物控制的發(fā)展。
相關(guān)新聞推薦
1、枯草芽孢桿菌LBD-1形態(tài)特征、生長曲線、抗逆性及發(fā)酵后飼料特性（一）
2、貓皰疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株一步生長曲線及生物學(xué)特性研究——結(jié)果與分析、討論
3、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸3種酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑制作用與機制（一）