?梅花鹿源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定、測(cè)序、毒素型、生化、耐藥性分析（二）
1.5.3 PCR毒素分型鑒定取純化后的菌液作為模板，反應(yīng)體系為模板2μL，上、下游引物各1μL,2x Green Taq Mix 10μL,ddH2O補(bǔ)足20μL,每對(duì)引物單獨(dú)體系。參照Nguyen等的引20μL,每對(duì)引物單獨(dú)體系。參照Nguyen等的引物序列對(duì)分離株毒素進(jìn)行鑒定,引物信息見表1。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。產(chǎn)氣莢膜梭菌分型系統(tǒng)為A型(cpa+)、B型(cpa+,cpb+,etx+)、C型(cpa+,cpb+,cpe+/-)、D型(cpa+,etx+,cpe+/-)、E型(cpa+,itx+,cpe+/-)、F型(cpa+、cpe+)、G型(cpa+、NetB+)。
1.6生化鑒定
嚴(yán)格按照微量生化反應(yīng)管使用說明和判定原則對(duì)分離株進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，分別進(jìn)行了蔗糖、鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、木糖、棉子糖、乳糖、阿拉伯糖、明膠、硝酸鹽、硫化氫、尿素共13種生化鑒定反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果與《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第八版中產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株生化特征進(jìn)行比對(duì)。
1.7藥敏試驗(yàn)
根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)推薦的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌對(duì)21種常用抗菌藥物的敏感性。挑TSC上單菌落接種于RCM培養(yǎng)基,石蠟液封,42℃培養(yǎng),當(dāng)OD{}_{600~nm}=0.6~0.8時(shí),吸取300μL菌液均勻地平鋪于Muel-ler-Hinton瓊脂,隨后將21種抗生素藥敏紙片放置于培養(yǎng)基上,42℃厭氧培養(yǎng)24h。利用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑,并參照CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》和制造商的說明書對(duì)分離菌的耐藥情況進(jìn)行判定。
1.8半數(shù)致死量檢測(cè)及病理觀察
48只小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，雌雄分籠，1~5組為試驗(yàn)組(D1~D5組),6組為健康對(duì)照組(H組)。通過預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)LD。和LD100。將LD
作為第1組攻毒劑量,LD100作為最后1組攻毒劑量,各組劑量按等比排列,公比r=√LD100/LD0(G為組數(shù))將小鼠隨機(jī)分成G組，每組8只小鼠。試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射菌液0.2mL,對(duì)照組每只小鼠腹腔注射0.2mL無菌生理鹽水。注射后密切觀察小鼠3d內(nèi)死亡情況并做好試驗(yàn)記錄，癥狀明顯的小鼠采樣心、肝、脾、肺、腎、小腸等組織制作病理組織切片并觀察。使用SPSS19.0軟件錄入數(shù)據(jù)，按照“分析”→“回歸”→“概率P”→“確定”的步驟分析計(jì)算，當(dāng)P=0.5時(shí)所對(duì)應(yīng)的值即為菌株的LD50及95%置信區(qū)間。
繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線為y=0.0064x+0.221 9,R2=0.9784具有強(qiáng)相關(guān)性(P<0.001)。腎臟和腸內(nèi)容物樣本OD{}_{450~nm}分別為0.624、1.003,帶入回歸曲線計(jì)算可得肝臟和腸內(nèi)容物中a毒素含量分別為62.86、122.12 ng·mL{}^{-1}。
2結(jié)果
2.1 a毒素鑒定
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng) OD值作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線為y=0.0064x+0.2219,R2=0.9784具有強(qiáng)相關(guān)性(P<0.001)。腎臟和腸內(nèi)容物樣本 OD450nm 分別為 0.624、1.003,帶入回歸曲線計(jì)算可得肝臟和腸內(nèi)容物中 α毒素含量分別為62.86、122.12ng·mL-1。
2.2 細(xì)菌分離鑒定及毒素分型
2.2.1 細(xì)菌分離鑒定分離菌株在RCM液體培養(yǎng)基中生長時(shí)出現(xiàn)渾濁并產(chǎn)生氣泡;在胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂(TSC)培養(yǎng)基上形成直徑2~5mm的外圍含有一圈白色暈圈的圓形黑色菌落(圖1A);在7%羊血瓊脂培養(yǎng)基上可形成表面光滑、顏色灰白、透明狀的圓形菌落(圖1B);鏡檢為革蘭陽性短桿菌(圖1C)。
2.2.2 16S rRNA檢測(cè)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1500bp(圖2),與預(yù)期長度一以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，
A.TSC培養(yǎng)基;B.7%羊血瓊脂培養(yǎng)基;C.鏡檢結(jié)果(10x100)
圖1分離株的培養(yǎng)特性及染色鏡檢
致。將測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果顯示分離株與產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌株相似率均在99%以上，確定該分離株為產(chǎn)氣莢膜梭菌，且與新疆上傳的產(chǎn)氣莢膜梭菌序列(PP627254.1)處于同一分支(圖3)，親緣關(guān)系較近。
2.2.3 PCR毒素分型鑒定
如圖4所示，多重PCR結(jié)果顯示分離株僅在cpa基因處出現(xiàn)目的條帶，條帶大小符合預(yù)期的324bp，未擴(kuò)增出其余毒素分型基因，該菌株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
2.3生化試驗(yàn)鑒定
分離株能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖，液化明膠,硝酸鹽還原試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)陽性;不能發(fā)酵鼠李糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、棉子糖，尿素試驗(yàn)陰性,符合《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中產(chǎn)氣莢膜梭菌生化特性。
2.2.2 16S rRNA檢測(cè)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1500bp(圖2),與預(yù)期長度一樣。
M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.分離株樣本;N.空白對(duì)照
圖2 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增電泳圖
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