滇黃精水提物促進(jìn)羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)增殖和定植的作用機(jī)制（二）
2方法
2.1滇黃精水提物的提取制備與菌株活化
參考陳秋定[4]方法提取滇黃精水提物及L.reuteri 1.2838的活化。
2.2滇黃精水提物對(duì)L.reuteri 1.2838增殖的影響
挑取活化后的單菌落接種于MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作為種子液。將種子液按1∶100（v/v）接種量分別接種到MRS液體培養(yǎng)基和含有滇黃精水提物的MRS培養(yǎng)基（水提物濃度為0.0126 g·mL-1）中，37℃、180 r·min-1厭氧培養(yǎng)。自0 h起，每隔2 h吸取培養(yǎng)液加入96孔板中用全波長(zhǎng)掃描多功能酶標(biāo)儀測(cè)量OD600 nm值。所有組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，記錄數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線。
2.3滇黃精水提物對(duì)L.reuteri 1.2838群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2生成的影響
2.3.1 L.reuteri 1.2838與滇黃精共孵育菌液的制備
向空白MRS培養(yǎng)液中添加滇黃精水提物至濃度為0.0126 g·mL-1，按1∶100（v/v）接種量接種2.1中活化的種子液。厭氧條件下，37℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h[4]。所得菌液在4℃條件下，12000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，向所得菌體沉淀中加入磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）重懸，再次以上述條件離心，棄去上清液，洗去滇黃精水提物殘留。向所得菌體中加入新的MRS培養(yǎng)液，調(diào)整菌液OD600 nm值為0.6-0.8，按1%接種量接種于新的MRS培養(yǎng)液中，37℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h，取培養(yǎng)后菌液2 mL，12000 r·min-1離心10 min取上清液用0.22μm的濾頭過(guò)濾，作為群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2的待測(cè)樣品?？瞻讓?duì)照為未添加滇黃精水提物共孵育的L.reuteri 1.2838菌液。
2.3.2自身誘導(dǎo)因子AI-2的檢測(cè)方法
參照陳秋定[4]和Ismail[9]的方法。制備Vibrio harveyi BB170菌株種子液，以1∶5000（體積比）轉(zhuǎn)接到2216E液體培養(yǎng)基中作為檢測(cè)樣品，取9 mL哈維氏菌檢測(cè)液加入2.3.1所得群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2待測(cè)樣品1 mL，30℃、180 r·min-1通氣培養(yǎng)1 h。取2216E液體培養(yǎng)基重復(fù)以上操作，作為陰性對(duì)照組。到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后，每管吸取200μL加入96孔平底發(fā)光板中檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，用全波長(zhǎng)掃描多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光量，計(jì)算AI-2活性的相對(duì)光單位（Relative light unit，RLU）。
RLU=A÷B，式中，A——待測(cè)樣品化學(xué)發(fā)光量的平均值；B——陰性對(duì)照化學(xué)發(fā)光量的平均值。
2.4滇黃精水提物對(duì)L.reuteri 1.2838基因轉(zhuǎn)錄的影響
2.4.1 RNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序
采用Trizol法提取L.reuteri 1.2838菌體RNA。利用超微量分光光度計(jì)對(duì)所提的RNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，用Agilent 5300生物分析儀測(cè)定RNA質(zhì)量。采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法建庫(kù)。在Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
2.4.2轉(zhuǎn)錄組分析
實(shí)驗(yàn)通過(guò)RSEM對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，指標(biāo)為FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments），利用DESeq 2、Padjust等方面對(duì)基因的表達(dá)量及差異倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定顯著差異表達(dá)基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，確定差異基因的功能分布與涉及通路。
2.5逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）驗(yàn)證差異基因的表達(dá)水平。首先將2.4中獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的結(jié)果，以16S rRNA為內(nèi)參基因，選擇dna K、ndk、secA基因進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，具體序列見(jiàn)表1。最后計(jì)算相對(duì)表達(dá)量差異2-ΔΔCT。
表1 qRT-RCR擴(kuò)增特異引物
2.6數(shù)理統(tǒng)計(jì)與分析
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 10統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)結(jié)果均取*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001作為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。
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