基于細(xì)菌生長曲線測定探究具核梭桿菌促進(jìn)肺癌發(fā)展的潛在機(jī)制（三）
2.2具核梭桿菌促進(jìn)小鼠肺癌轉(zhuǎn)移
采用C57小鼠進(jìn)行尾靜脈注射造模實(shí)驗(yàn)，通過肺部遞送2種具核梭桿菌或PBS(圖2A)。造模成功后收集3組小鼠的肺組織，并使用IVIS Spectrum系統(tǒng)進(jìn)行拍照(圖2B)。結(jié)果顯示，F(xiàn)n-9組和Fn-ATCC組肺組織的熒光強(qiáng)度顯著高于PBS組(圖2C)。統(tǒng)計(jì)肺結(jié)節(jié)數(shù)量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n-9組和Fn-ATCC組的數(shù)量顯著高于對照組(圖2D)。同時(shí)，2組的肺器官系數(shù)也均高于PBS組(圖2E)。這些結(jié)果表明，具核梭桿菌可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。
圖2具核梭桿菌促進(jìn)小鼠肺癌轉(zhuǎn)移。A：實(shí)驗(yàn)流程圖；B、C：Fn-9、Fn-ATCC和PBS 3組熒光強(qiáng)度比較；D、E：3組肺結(jié)節(jié)數(shù)量和肺器官系數(shù)。
為了進(jìn)一步了解3組小鼠的肺損傷情況，對肺切片進(jìn)行了HE染色分析。病理結(jié)果顯示，3組小鼠的肺部均有炎癥細(xì)胞浸潤，但Fn-9組和Fn-ATCC組的肺泡間隔破壞更為嚴(yán)重，部分氣道黏膜上皮也出現(xiàn)萎縮(圖3A)。值得注意的是，2組的肺腫瘤面積明顯增大，肺結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多(圖3A)。同樣地，qPCR檢測3組小鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n-9組和Fn-ATCC組的IL-1β和TNF-α表達(dá)量更高(圖3B、3C)，而IL-6的表達(dá)在3組之間無顯著差異(圖3D)。綜上所述，在動物水平上證明了具核梭桿菌促進(jìn)了肺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。
圖3病理切片圖和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)。A：Fn-9、Fn-ATCC和PBS 3組肺組織切片；B-D：IL-1β、TNF-α和IL-6在小鼠肺組織中的表達(dá)(ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*：
2.3具核梭桿菌對小鼠肺部微生物群的影響
收集上述各組及正常小鼠的肺泡灌洗液，探討具核梭桿菌對肺微生物群的影響。在屬水平，F(xiàn)n-9組和Fn-ATCC組細(xì)菌組成明顯不同于PBS組(圖4A)。Chao1指數(shù)表明，F(xiàn)n-9組的α多樣性顯著高于空白組(圖4B)。然而，4組間的β多樣性無顯著差異(圖4C)。MetagenomeSeq分析顯示，F(xiàn)n-9組和Fn-ATCC組中Muribaculum的豐度顯著低于PBS組，而Fn-9組中Simplicispira的豐度顯著高于PBS組(圖4D)。
圖4具核梭桿菌對肺部微生物群的影響。A：4組菌屬水平前20個豐度的群落條形圖；B：4組肺泡灌洗液的Chao1指數(shù)(P值通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)計(jì)算，*：P<0.05)；C：4組肺泡灌洗液的PCoA圖(ANOSIM用于統(tǒng)計(jì)評估顯著差異)；D：MetagenomeSeq檢測4組之間的差異物種(*：P<0.05)。
2.4肺組織轉(zhuǎn)錄組分析
轉(zhuǎn)錄組測序用于描述肺組織變化的特征。主成分分析(principal components analysis,PCA)結(jié)果顯示，F(xiàn)n-9組、Fn-ATCC組和PBS組的轉(zhuǎn)錄組基因存在顯著差異(圖5A)。進(jìn)一步通過火山圖比較其差異基因的變化，發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，F(xiàn)n-ATCC組共有1 855個差異基因表達(dá)上調(diào)，1 185個差異基因表達(dá)下調(diào)(圖5B)；而在Fn-9組與PBS組的比較中，F(xiàn)n-9組共有864個差異基因表達(dá)上調(diào)，640個差異基因表達(dá)下調(diào)(圖5C)。隨后，分析了3組小鼠肺組織中KEGG通路差異基因的富集情況。在Fn-9組、Fn-ATCC組和PBS組的比較中，差異基因主要富集在IL-17信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞周期和運(yùn)動蛋白等信號通路上，這提示Fn-9組和Fn-ATCC組2種菌株可能通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來促進(jìn)肺癌的進(jìn)展(圖5D、5E)。
圖5感染后肺癌組織的轉(zhuǎn)錄組。A：3組樣本間的主成分分析；B、C：差異基因表達(dá)分析的火山圖；D：Fn-ATCC與PBS之間RNA-seq數(shù)據(jù)中差異基因的KEGG通路富集分析；E：Fn-9與PBS之間RNA-seq數(shù)據(jù)中差異基因的KEGG通路富集分析。
3討論與結(jié)論
傳統(tǒng)上，肺一直被認(rèn)為是一個無菌器官，隨著分子測序技術(shù)的發(fā)展證實(shí)肺中實(shí)際上存在少量微生物，這可能是由于口腔、上呼吸道、下呼吸道和肺直接接觸導(dǎo)致呼吸道或口腔中的微生物進(jìn)入呼吸道并在肺中定殖[12-14]。根據(jù)目前的理論，大多數(shù)微生物通過上呼吸道以及微量吸入的方式進(jìn)入肺部[14-16]。相比之下，某些微生物已被證實(shí)會增加患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)[17]。作為口腔中常見的條件致病菌，具核梭桿菌已被證明與多種疾病相關(guān)[18-20]。具核梭桿菌與牙齦卟啉單胞菌協(xié)同作用可誘發(fā)牙周炎，并促進(jìn)口腔癌的發(fā)展[4,21-22]。除口腔疾病外，研究人員還在結(jié)直腸癌患者的組織中檢測到高豐度的具核梭桿菌[23-24]，并進(jìn)一步證實(shí)具核梭桿菌對結(jié)直腸癌有促進(jìn)作用[6,25]。從作用機(jī)制上看，具核梭桿菌能激活A(yù)pcmin/+小鼠的NF-κB信號通路，并誘導(dǎo)TNF、IL-6、IL-8和IL-1β等促癌通路[8,26]。然而，目前尚無直接證據(jù)表明具核梭桿菌與肺癌有關(guān)。
本研究首先選擇了2種不同來源的具核梭桿菌菌株：一種是ATCC 25586標(biāo)準(zhǔn)菌株，另一種是從肺癌患者肺泡灌洗液中提取的具核梭桿菌動物亞種。與其他亞種相比，動物亞種具核梭桿菌在結(jié)直腸癌生態(tài)區(qū)域中占主導(dǎo)地位[27]。在動物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)向小鼠肺部遞送具核梭桿菌可促進(jìn)肺結(jié)節(jié)數(shù)量的增加，并且實(shí)驗(yàn)組的肺組織在熒光成像下比對照組的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織中TNF-α和IL-1β基因的表達(dá)顯著增加。研究也表明，TNF-α在肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、侵襲、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展過程中起著重要作用，這在TNFR2-KO小鼠植入Lewis肺癌(LLC)模型中也得到了證實(shí)[28-29]。IL-1β也被證實(shí)在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)升高，并在肺癌的轉(zhuǎn)移發(fā)展中發(fā)揮重要作用[30-31]。
根據(jù)肺泡灌洗液的16S rRNA基因測序結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)組和PBS組之間發(fā)現(xiàn)了2個不同的屬：簡單螺旋形菌屬(Simplicispira)和鼠桿狀菌屬(Muribaculum)。簡單螺旋形菌屬是一種常見于土壤、水庫和污泥中的細(xì)菌，尚未見與癌癥相關(guān)的報(bào)道[32-33]。鼠桿狀菌屬與腸道微生物群中的脂質(zhì)代謝以及結(jié)直腸癌中的腸道微生物菌群失調(diào)有關(guān)[34-35]。肺組織轉(zhuǎn)錄組KEGG結(jié)果表明，具核梭桿菌可能通過免疫相關(guān)信號通路促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路與腫瘤密切相關(guān)，研究證實(shí)齊墩果酸可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路來調(diào)控乳酸菌抑制腫瘤的發(fā)展，TRIM6也通過該通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[36-37]。同樣地，TNF信號通路也參與了細(xì)胞凋亡及其對癌癥疾病的影響[38-39]。具核梭桿菌進(jìn)入小鼠肺部后，激活了金黃色葡萄球菌感染途徑，而金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的促炎能力，能引起肺炎等疾病[40-41]。肺部炎癥會誘發(fā)肺部微環(huán)境的改變，從而導(dǎo)致肺癌病變[42]。此外，盡管在結(jié)直腸癌研究中已顯示具核梭桿菌能夠進(jìn)入腸上皮細(xì)胞發(fā)揮作用，但對于具核梭桿菌是否能進(jìn)入肺上皮細(xì)胞尚無相關(guān)報(bào)道，這也是后續(xù)機(jī)制研究的方向之一。
綜上所述，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了具核梭桿菌能促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它能促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移和惡化。根據(jù)16S rRNA基因測序結(jié)果和肺組織轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，具核梭桿菌進(jìn)入小鼠肺部后擾亂了肺部菌群的組成，激活了肺組織中多個與炎癥和免疫相關(guān)的信號通路，這可能是具核梭桿菌促進(jìn)肺癌的潛在機(jī)制。
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