基于細菌生長曲線測定探究具核梭桿菌促進肺癌發(fā)展的潛在機制（一）
摘要
目的探究具核梭桿菌是否會促進肺癌的發(fā)展及其潛在機制。
方法通過細胞實驗證實具核梭桿菌能促進肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；通過動物實驗驗證具核梭桿菌能促進肺癌的發(fā)展。對肺癌小鼠的肺泡灌洗液進行16S rRNA基因測序，以及對肺組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析具核梭桿菌對肺癌小鼠肺部菌群的影響及肺組織相關(guān)通路的激活情況。
結(jié)果具核梭桿菌促進了肺癌上皮細胞A549的增殖和轉(zhuǎn)移。在體內(nèi)動物實驗中，具核梭桿菌感染肺部后肺部結(jié)節(jié)數(shù)量增加，肺組織熒光強度增強。16S rRNA基因測序結(jié)果顯示，感染小鼠肺部鼠桿狀菌屬(Muribaculum)、簡單螺旋形菌屬(Simplicispira)等富集。肺組織轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，肺癌小鼠感染具核梭桿菌后激活了IL-17信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、金黃色葡萄球菌感染通路、TNF信號通路等與炎癥或免疫相關(guān)的信號通路。
結(jié)論具核梭桿菌感染導(dǎo)致肺部微生物群紊亂，肺組織中多個與炎癥和免疫相關(guān)的信號通路被激活，從而促進了小鼠肺癌的轉(zhuǎn)移。
肺癌嚴重威脅著人類的身體健康。每年有100萬至800萬人被診斷出患有肺癌，其中約100萬至600萬人死于肺癌[1]。雖然導(dǎo)致肺癌的原因很多，但吸煙仍是主要的風(fēng)險因素。其他非吸煙因素包括環(huán)境和職業(yè)暴露、慢性肺部疾病、肺部感染以及不良生活方式等[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在非吸煙人群中肺癌與以慢性氣道炎癥為特征的疾病密切相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾病、肺炎衣原體感染、結(jié)核分枝桿菌引起的肺結(jié)核和呼吸道病毒感染等[3]。這些結(jié)果表明，肺部微生物可能在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。具核梭桿菌是口腔中常見的革蘭氏陰性厭氧菌。它與牙齦卟啉單胞菌及其他微生物共同破壞宿主與微生物之間的平衡，誘發(fā)牙周炎[4-5]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌也能在結(jié)直腸癌組織中富集。進一步研究表明，具核梭桿菌能夠促進結(jié)直腸癌的發(fā)展[6-7]。在ApcMin/+小鼠模型中，通過灌胃方式將具核梭桿菌引入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示其會促進結(jié)直腸癌的發(fā)生[8]。此外，研究人員利用培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)從肺癌患者的肺泡灌洗液中分離出具核梭桿菌，并通過分析口腔微生物、牙周病與肺癌之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌可能是肺癌標(biāo)志物的潛在微生物之一[9-11]。
本研究探討了具核梭桿菌促進肺癌發(fā)展的潛在機制。
1材料與方法
1.1實驗菌株與細胞
具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)ATCC 25586購自廣東省微生物菌種保藏中心。具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)strain-9從北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院肺癌患者的肺泡灌洗液中分離并在本實驗室保存[9]。以上菌株分別命名為Fn-ATCC和Fn-9。
肺癌上皮細胞A549、人單核細胞白血病THP-1細胞、帶有綠色熒光蛋白的小鼠Lewis肺癌細胞(LLC-GFP)均為本實驗室保存。
1.2實驗動物
選擇8周齡、雌性野生型無特定病原體(specific-pathogen-free,SPF)級C57BL/6N小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心。
1.3主要試劑和儀器
MTT試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell孔板購自康寧公司；ELISA試劑盒購自達科為生物技術(shù)股份有限公司；RNA提取試劑盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript III RT SuperMix for qPCR試劑盒和SYBR Green qPCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。
IVIS Spectrum小動物活體光學(xué)成像系統(tǒng)、PerkinElmer Operetta CLSTM高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)均購自PerkinElmer公司。
1.4細菌生長曲線的測定
將Fn-9和Fn-ATCC菌液的OD600值調(diào)至1.0時，菌液濃度分別為5×107 CFU/mL和1×108 CFU/mL。在24孔板中加入2 mL BHI(腦心浸液肉湯)培養(yǎng)基，并加入50μL上述調(diào)好的菌液。培養(yǎng)12 h后取出菌液檢測OD600值，之后每隔2 h取出孔板中的菌液測量OD600值，直至36 h結(jié)束。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism軟件中繪制曲線圖。
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