O 型口蹄疫病毒 3D 突變體重組 FMDV 的鑒定及生長曲線的測定（一）
摘要： 本研究利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建 O 型口蹄疫病毒（FMDV）3D 蛋白突變毒株 rFMDV-M403A，并分析了其生物學(xué)特征。 結(jié)果表明，重組病毒在傳代過程中氨基酸能穩(wěn)定突變；病毒滴度顯示，突變毒株生長速度較野生毒株有所降低，重組病毒毒力顯著低于野生毒株；乳鼠感染試驗結(jié)果顯示，突變毒株會使乳鼠存活率提高，肝中病毒載量和組織病變顯著降低。 該研究對口蹄疫病毒致病機理的認(rèn)識及制定防控措施具有重要意義，同時，也為后續(xù)開發(fā)口蹄疫基因工程疫苗奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。
口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是一種嚴(yán)重危害偶蹄動物健康的急性、熱性、高度接觸性傳染病，對偶蹄動物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，其病原是口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）。FMDV 的結(jié)構(gòu)由一條單鏈正鏈 RNA 和其周圍的衣殼蛋白組成，病毒外殼呈現(xiàn)對稱的二十面體。 該病毒存在 7 個血清型，分別為 A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3 和 Asia1 型，各型之間無交叉保護反應(yīng)。 O 型 FMDV 是最為常見和廣泛流行的血清型之一。
FMDV 基因組編碼 4 種結(jié)構(gòu)蛋白和 9 種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中口蹄疫 3D 蛋白是口蹄疫病毒編碼的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，在口蹄疫病毒的復(fù)制過程中起關(guān)鍵作用。 它具有 RNA 聚合酶的活性，能夠催化病毒 RNA 的合成，對于病毒基因組的復(fù)制以及新病毒粒子的產(chǎn)生是必不可少的。 3D 蛋白在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組裝過程中起著關(guān)鍵的輔助作用，確保能夠形成完整的病毒粒子，一旦 3D 蛋白的功能受到抑制或被破壞，會導(dǎo)致病毒粒子的組裝過程發(fā)生異常，進而削弱病毒的感染能力。 因此，對于口蹄疫的診斷與防控而言，3D 蛋白不可忽視。 可以說，3D 蛋白在口蹄疫病毒的復(fù)制周期和致病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 構(gòu)建 O 型口蹄疫病毒 3D 突變毒株并分析其生物學(xué)特征，對深入理解口蹄疫病毒的致病機制和制定防控策略具有重要意義。
現(xiàn)如今，利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建全長 cDNA 克隆并拯救病毒已經(jīng)成為深入研究 FMDV 的一種重要手段。 本研究利用反向遺傳技術(shù)，對病毒蛋白進行突變改造，研究重組后的口蹄疫病毒 rFMDV-M403A 對乳鼠特異性免疫的影響，為進一步研制口蹄疫基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 毒株、菌種和細(xì)胞株
O 型 rFMDV-WT 親本毒株由國家口蹄疫參考實驗室保存。 大腸桿菌 DH5α 購自深圳康體生命科技有限公司。 pcDNA3.1 載體和 BHK21 細(xì)胞為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行病學(xué)團隊保存。
1.2 主要試劑
限制性核酸內(nèi)切酶（Not Ⅰ、BamH Ⅰ）購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司。 DNA Marker 購自北京擎科生物科技股份有限公司。 膠回收試劑盒購自美國 Omega England Biolabs 公司。 T4 DNA 連接酶購自 New England Biolabs 公司。 質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。 Lip3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）購自 Invitrogen 公司。 Trizol 試劑、Prime STAR Max 高保真 DNA 聚合酶均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。 反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase）購自諾唯贊生物科技股份有限公司。 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。 胎牛血清（FBS）購自 Biological Industries（BI）公司。 0.05％ EDTA 胰酶購自 Gibco 公司。 組織研磨珠（氧化鋯）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。 探針一步法 RT-PCR 定量檢測試劑盒購自上海百賽生物科技股份有限公司。
1.3 含突變氨基酸全長質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù) O 型口蹄疫病毒全長 cDNA 序列，設(shè)計含有 Not Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切位點的 403 位氨基酸（3D-M403A）突變的目的基因片段，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 經(jīng) Not Ⅰ和 BamH Ⅰ酶消化后，膠回收約 3 172 bp 的目的片段，將其連接到 pcDNA3.1（＋）載體上，得到含有突變氨基酸的全長質(zhì)粒 pFMDV-3D-M403A-O，得到的質(zhì)粒送北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。
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