釀酒酵母和耐熱酵母屬間原生質(zhì)體融合頻率及方法
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)396是利用甘蔗糖蜜生產(chǎn)酒精的生產(chǎn)菌株，假絲酵母(Candidasp.)C6是我們從云南溫泉底泥中篩選到的一株能在45℃生長良好的耐熱酵母，我們應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行了兩菌株屬間融合的研究。通過亞硝基胍(NTG)誘變得到的營養(yǎng)缺陷型菌株396(arg-)和C6(lys-)，其融合頻率為0.91x10-5。從檢出的融合子中挑選6株進(jìn)行考核、其細(xì)胞體積平均為親株的1.3倍，DNA含量平均為親株的1.6倍，培養(yǎng)特征、形態(tài)、大小和生理生化特征表現(xiàn)不一，特別是糖類的同化試驗(yàn)。除F2、F14外，其他4株可以排除異核體形成的可能性。比較了在28℃，40℃和45℃培養(yǎng)條件下出發(fā)親株396、C6、直接親株396(arg-)C6(1ys-)和融合子F1、F7、F12、F13的生長曲線、基質(zhì)利用率和乙醇產(chǎn)率等，得到一株在40℃培養(yǎng)條件下糖的利用率為94.3%、乙醇產(chǎn)量為59.7g/L的屬間融合株F13。
自1977年Ferenczy等將原生質(zhì)體融合技術(shù)用于酵母以來，關(guān)于酵母菌的種內(nèi)融合和種間融合有不少報(bào)道。1978年P(guān)rovos+等又報(bào)道獲得了熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)和扣囊復(fù)膜孢酵母(Saceharo-mycopsis fibuligera)的屬間融合子。1984年品川早苗將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)N1，一株高產(chǎn)乙醇但不耐熱的菌株與耐高溫的菌株TJ1融合得到AM 12，可以在40℃高產(chǎn)酒精。
本文對生產(chǎn)酒精的釀酒酵母(S.cere-visiae)396和能在45℃生長良好的耐熱酵母(Candida sp.)C。的屬間原生質(zhì)體融合進(jìn)行了研究。
材料與方法
(一)菌株
原始出發(fā)菌菌株:釀酒酵母(Saccha-10nyces cerevisiae)396是云南省建水糖廠提供的甘蔗糖蜜酒精生產(chǎn)菌株;假絲酵母(Candida sp.)C。是我們從云南溫泉的底泥中分離到的一株能在45℃生長良好，并能發(fā)酵糖產(chǎn)生乙醇的耐熱酵母。融合用直接親株則是以上兩菌株經(jīng)NTG誘變后得到的營養(yǎng)缺陷型菌株396(arg-)和C。(lys-)。
(二)培養(yǎng)基
完全培養(yǎng)基(YPD)(%):酵母粉(上海酵母廠)0.5，蛋白胨1，葡萄糖2，固體加瓊脂2;高滲完全培養(yǎng)基(YPD)即YPD加17%蔗糖;基本培養(yǎng)基(YNB)采用Wi-加17%蔗糖;基本培養(yǎng)基(YNB)采用Wi-cherham培養(yǎng)基;融合子檢出培養(yǎng)基(YNBS)即YNB加蔗糖17%。
酒精發(fā)酵用培養(yǎng)基:甘蔗糖蜜(云南省建水糖廠提供)17Bx°，硫酸銨0.2%，磷酸0.1%，pH4.5。
(三)試劑
0.2mol/L磷酸緩沖液(PB)，pH5.8;亞硝基胍(NTG)-PB誘變劑中NTG濃度
1mg/ml，使用劑量250ug/ml;制霉菌素(NY)誘變濃縮劑使用劑量150μg/ml,用二甲基甲酸胺溶解NY;用于耐熱酵母C_6left(1,s^{-}right)的預(yù)處理劑是Tris 100mmol/L,DTT(二硫基蘇糖醇)5 mmol/L,EDTA 5 mmol/L;用于釀酒酵母396(arg-)的預(yù)處理劑是Tris 100mmol,巰基乙醇0.5%;脫壁酶液是中科院生物物理所提供的蝸牛酶0.5%(1%)加0.7mmol/L甘露醇溶于磷酸緩沖液(PB)中,使用前配制并用G 6細(xì)菌漏斗過濾除菌;助融劑為35%聚乙二醇(PEG MW.6000)-10mmol/L氯化鈣溶液。
(四)方法
采用文獻(xiàn)和的方法通過NTG誘變出發(fā)菌株后,又采用文獻(xiàn)的方法用NY濃縮出營養(yǎng)缺陷型菌株,最后用Fin-cham等的方法進(jìn)行菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型的鑒定;原生質(zhì)體的制備、再生和融合的方法參考文獻(xiàn)和;DNA的測定參考文獻(xiàn)的方法，用2g重結(jié)晶二苯胺加入100ml冰乙酸和10ml高氯酸，使用前加入1.6%的乙醛溶液1ml,30℃保溫14h。采用酶解法破壁后提取DNA，但C。有少數(shù)細(xì)胞壁未破，異核體的檢測參考文獻(xiàn)的方法，乙醇含量的測定采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，內(nèi)標(biāo)物用甲乙酮;糖量的測定用3,5-二硝基水楊酸定糖法。
(五)參數(shù)的計(jì)算
1.突變率(a):a=left(M-M_0right)/left(N_0-right.N),式中M。:起始突變數(shù),一般為0,M:最后的突變數(shù)，No:起始活細(xì)胞數(shù)，N:最后活細(xì)胞數(shù)。
2.原生質(zhì)體形成率和再生率:原生質(zhì)體形成率(%)=(A-B)/Ax100%;原生質(zhì)體再生率(%)=(C-B)/(A-B)x 100%;A:蝸牛酶處理前菌落數(shù)(YPD平血);B:蝸牛酶處理后未脫壁細(xì)胞形成的
菌落數(shù)(YPD平血);C:蝸牛酶處理后未脫壁細(xì)胞形成的菌落數(shù)加原生質(zhì)體再生細(xì)胞菌落數(shù)(YPD平血)。
3.原生質(zhì)體融合頻率(Ff):
結(jié)果與討論
(一)營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記菌株的獲得
用250μg/mlNTG誘變1h,150μg/ml NY濃縮后檢出精氨酸缺陷型菌株396（arg-)、賴氨酸缺陷型菌株和亮氨酸缺陷型菌株Cσ(lcu-)(表1)。
396(arg-)和Cσ(lS-)沒有檢出回復(fù)突變株,而C_8left(right.leuleft.^{-}right)的回復(fù)突變率為10^{-4}。從細(xì)胞形態(tài)上觀察396（arg-)和C_8left(1~s^{-}right)都與原出發(fā)菌株相似，而C_6(leu-)不論在YPD固體培養(yǎng)基上或液體培養(yǎng)基中均呈簇生的假菌絲型,不宜用于融合。
(二)原生質(zhì)體的制備和融合
營養(yǎng)缺陷型菌株靜止培養(yǎng)14h,離心收集菌體,30^{circ}C預(yù)處理20min后進(jìn)行脫壁。由于0.5%和1.0%的蝸牛酶對396(arg-)的脫壁率分別為78.04%和77.77%(血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)),差異不太大,所以我們采用0.5%蝸牛酶。396(arg-)的細(xì)胞濃度為4.05times 10^6 cells/ml,原生質(zhì)體形成率為92.86%，再生率為4.83%。而Ce(lys-)的細(xì)胞濃度為2.0x10°cells/ml,原生質(zhì)體形成率為84.57%，再生率為7.75%。C。(lys)的細(xì)胞破壁較396(arg-)困難一些。
營養(yǎng)需求看除了F，在YNB上有時生長，有時不生長，而在補(bǔ)充了精氨酸的YNB平皿上完全不生長外，其他均為原養(yǎng)型菌株，融合子與原始親株和直接親株的生物學(xué)特性比較見表2。DNA含量的比較見表3。
(三)融合子的生物學(xué)特性
隨機(jī)挑出6株融合子進(jìn)行考核。從其從表2和表3可以看出融合子的培養(yǎng)特征形態(tài)，大小、每個細(xì)胞的DNA含量和生理生化特征表現(xiàn)不一，特別是糖類同化更是多樣，其細(xì)胞體積平均為親株的1.3倍，DNA含量平均為親株的1.6倍。
對融合子異核體的檢查結(jié)果(表4)除F2和F14外，其他4株F1、F7、F12和F13可以排除異核形成的可能性。
(四)融合子的耐熱性和乙醇產(chǎn)量
1.在不同溫度條件下親株和融合子的生長曲線:出發(fā)親株、直接親株和融合子在YPD液體培養(yǎng)中靜止培養(yǎng)在28℃、42℃和45℃，72h的生長曲線(圖1)表明營養(yǎng)缺陷型菌株的耐熱性比出發(fā)菌株顯著下降，而回到原養(yǎng)型的融合子耐熱性雖然各株不一，但也都比原出發(fā)親株略差。
2.不同溫度條件下基質(zhì)消耗和乙醇產(chǎn)量的比較:各類型菌株在28℃、40℃和45℃培養(yǎng)條件下，利用甘蔗糖蜜發(fā)酵乙醇的各種參數(shù)(表5)表明，營養(yǎng)缺陷型菌株396(arg-)在不同溫度下，乙醇的產(chǎn)率和基質(zhì)的利用都比原出發(fā)親株:396低，經(jīng)過與耐熱菌株C。(1s-)融合后得到的融合子，只有F13一株乙醇產(chǎn)率和基質(zhì)利用率比較理想。在40℃和45℃下培養(yǎng)，乙醇產(chǎn)量均高于原生產(chǎn)菌株396。
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