苯乳酸對霍氏腸桿菌生長曲線、細(xì)胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（四）
2.5 苯乳酸對霍氏腸桿菌DNA 的影響
除細(xì)胞膜靶機制外，部分抑菌劑也可通過影響細(xì)胞內(nèi)靶點而產(chǎn)生抗菌能力，如抑制DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成，破壞其它胞內(nèi)生物合成過程等。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳及分子對接研究了苯乳酸對霍氏腸桿菌基因組DNA 的靶向作用。圖4a 為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。與對照組相比，1/2 MIC 和MIC 組DNA 條帶亮度變化較小，而2 MIC 的條帶亮度幾乎消失。結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度的苯乳酸對霍氏腸桿菌DNA 靶向作用較弱，幾乎不會影響胞內(nèi)DNA 含量，也未破壞DNA 片段完整性。然而，隨著苯乳酸質(zhì)量濃度升高，造成了胞內(nèi)DNA 含量降低，這會干擾胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響細(xì)胞的正常生理功能。
圖4 苯乳酸與霍氏腸桿菌DNA 的相互作用
寧亞維等的研究結(jié)果表明苯乳酸與醋酸聯(lián)用可與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）DNA 結(jié)合，從而擾亂細(xì)胞正常生理代謝活動。寧亞維等的研究還發(fā)現(xiàn)苯乳酸可以破壞熒光假單胞菌（P.fluorescens）的DNA 結(jié)構(gòu)，與本研究結(jié)果相似，說明DNA 可能是苯乳酸抑菌的主要靶點之一。由圖4b 箭頭所指向的局部放大圖可以看出，苯乳酸可以與DNA 的腺嘌呤和鳥嘌呤形成6 個氫鍵，鍵距分別為2.0，2.3，2.3，2.3，2.6，2.7，結(jié)合能為-14.48 kJ/mol（-3.46 kcal/mol），表明苯乳酸與DNA 存在相互作用。Fang 等發(fā)現(xiàn)苯乳酸與副溶血弧菌DNA 的腺嘌呤和鳥嘌呤形成7 個氫鍵，結(jié)合能為-21.46 kJ/mol（-5.13 kcal/mol），與本研究結(jié)果相似。
2.6 苯乳酸對霍氏腸桿菌運動性的影響
細(xì)菌運動能力在生物被膜形成的初始階段發(fā)揮至關(guān)重要的作用，細(xì)胞運動性的喪失可能會導(dǎo)致霍氏腸桿菌在既定表面黏附，從而影響生物被膜的形成。圖5 顯示了不同質(zhì)量濃度苯乳酸處理的霍氏腸桿菌群集遷移直徑的變化。經(jīng)不同質(zhì)量濃度的苯乳酸處理后的霍氏腸桿菌的群集能力均顯著低于對照組（P ＜0.05），且隨著苯乳酸質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，說明苯乳酸對霍氏腸桿菌的群集能力具有顯著抑制作用。值得注意的是在亞抑菌濃度下這種抑制作用也是十分顯著的，細(xì)菌運動性的降低對抑制其生物被膜的形成起到重要作用。
圖5 苯乳酸對霍氏腸桿菌群集運動的影響
注：不同小寫字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。
2.7 苯乳酸對霍氏腸桿菌生物被膜的抑制作用
生物被膜是細(xì)菌的重要保護(hù)屏障，被包裹在生物被膜中的細(xì)菌細(xì)胞對抗生素和抑菌劑更具耐受性，因此抑制生物被膜的形成至關(guān)重要。由圖6 可以看出，1/2 MIC 苯乳酸處理組與對照組相比生物被膜的形成被顯著抑制（P＜0.05），而72 h 生物被膜生成量顯著高于48 h，表明此質(zhì)量濃度苯乳酸處理霍氏腸桿菌仍能形成生物被膜。在經(jīng)過MIC 與2 MIC 的苯乳酸處理后，生物被膜的形成受到強烈抑制，72 h 生物被膜生成量與48 h無顯著差異，表明此質(zhì)量濃度下幾乎沒有生物被膜形成。綜上，生物膜的形成量與時間呈正相關(guān)關(guān)系，苯乳酸對霍氏腸桿菌的生物被膜形成有較強的抑制作用，與Jiang 等的研究結(jié)果相似。
圖6 苯乳酸對霍氏腸桿菌生物被膜形成的影響
注：不同小寫字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。
2.8 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察生物被膜
觀察生物被膜的結(jié)構(gòu)對于了解苯乳酸的抑制生物被膜作用至關(guān)重要。用熒光染料對形成生物被膜的活細(xì)胞進(jìn)行染色，通過CLSM 觀察生物被膜熒光變化。圖7 是對照組與苯乳酸處理組霍氏腸桿菌生物被膜的激光共聚焦顯微立體圖像。對照組的生物被膜較厚，活菌數(shù)多，細(xì)菌較為密集，表明霍氏腸桿菌具有較強的生物被膜形成能力。隨著苯乳酸質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的生物膜逐漸變薄，活菌數(shù)減少，細(xì)菌變得更加分散。結(jié)合苯乳酸對霍氏腸桿菌運動能力及生物被膜生成量的影響結(jié)果，表明苯乳酸可有效抑制了霍氏腸桿菌生物被膜的形成。
3 結(jié)論
苯乳酸作為一種天然無毒且具有廣譜抑菌作用的新型生物防腐劑，對霍氏腸桿菌具有較好的抗菌活性。苯乳酸對霍氏腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別是1.25 mg/mL 和2.5 mg/mL，苯乳酸通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，造成細(xì)胞壞死，并破壞菌體DNA，影響基因表達(dá)。此外，苯乳酸抑制霍氏腸桿菌的運動能力及生物被膜的形成。本研究可為苯乳酸的抑菌及其生物被膜的機制的深入研究提供一定的理論參考。
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