苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞凋亡、抑制活性、DNA的影響（三）
2 結(jié)果與分析
2.1 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌抑制活性的測(cè)定
MIC 是評(píng)價(jià)物質(zhì)抑菌能力的主要指標(biāo)之一。由表1 可知，當(dāng)苯乳酸的稀釋的質(zhì)量濃度最小達(dá)到1.25 mg/mL 時(shí)，不同培養(yǎng)溫度下96 孔板中均無(wú)菌生長(zhǎng)，因此確定苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌的MIC為1.25 mg/mL。當(dāng)苯乳酸質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)，繼續(xù)在LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24 h 上仍有少量菌落，而當(dāng)質(zhì)量濃度升至2.5 mg/mL 時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)，因此確定MBC 為2.5 mg/mL。結(jié)果表明，較低質(zhì)量濃度的苯乳酸可抑制霍氏腸桿菌的生長(zhǎng)，且存在質(zhì)量濃度依賴性。有文獻(xiàn)報(bào)道苯乳酸對(duì)大腸桿菌O157：H7（E.coli O157：H7）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的MIC 分別是1.25，1.25，1.5和2.5 mg/mL，說(shuō)明苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌的抑菌活性高于金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，而與大腸桿菌O157：H7 和熒光假單胞菌基本相同。
表1 不同溫度下苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌的MIC 測(cè)定結(jié)果
注：“+”表示觀察到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)，“—”表示細(xì)菌無(wú)明顯生長(zhǎng)。
2.2 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用
微生物生長(zhǎng)曲線能有效反映微生物數(shù)量隨時(shí)間變化。由28 ℃培養(yǎng)下霍氏腸桿菌的生長(zhǎng)曲線可知（圖1a），本試驗(yàn)中對(duì)照組霍氏腸桿菌在5 h 時(shí)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而加入1/2 MIC 苯乳酸后其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間延后1 h。在培養(yǎng)過(guò)程中，1/2 MIC 組OD 值相較于對(duì)照組偏小，而最終進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)與對(duì)照組最大生物量基本一致，說(shuō)明該質(zhì)量濃度下的苯乳酸無(wú)法完全抑制霍氏腸桿菌的生長(zhǎng)能力。圖1b 顯示37 ℃培養(yǎng)下的生長(zhǎng)曲線在3 h 時(shí)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，1/2 MIC 的OD 值一直小于對(duì)照組。然而，2 個(gè)培養(yǎng)溫度下MIC 與2 MIC 組中，OD 值在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中未增加，表明此時(shí)霍氏腸桿菌的生長(zhǎng)被完全抑制。37 ℃培養(yǎng)的霍氏腸桿菌較28 ℃培養(yǎng)能更快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期，生長(zhǎng)速率更快，而最大生物量無(wú)顯著差異。
圖1 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響
2.3 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌細(xì)胞凋亡的影響
碘化丙啶（PI）可以透過(guò)死亡或破損的細(xì)胞對(duì)DNA 進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞圖的4 個(gè)區(qū)域分別為存活細(xì)胞（左下）、早期凋亡（右下）、晚期凋亡（右上）和細(xì)胞壞死（左上）。由圖2 可知，在28 ℃培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)24 h，對(duì)照、1/2 MIC、MIC、2 MIC 組的細(xì)胞存活率分別為94.6%，93.7%，90.2%，81.8%，在37 ℃培養(yǎng)下，對(duì)照、1/2 MIC、MIC、2 MIC 的細(xì)胞存活率分別為93.3%，88.7%，90.0%，80.1%，表明苯乳酸1/2 MIC 和MIC 處理不會(huì)顯著導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，而在2 MIC 處理時(shí)，細(xì)胞壞死率分別達(dá)到11.4%和11.8%，說(shuō)明高質(zhì)量濃度下的苯乳酸會(huì)顯著造成細(xì)胞壞死。在28℃和37 ℃培養(yǎng)下的苯乳酸對(duì)菌的生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯差異，因此以28 ℃為培養(yǎng)條件進(jìn)行下列抗菌機(jī)制的研究。
圖2 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌細(xì)胞凋亡的影響
2.4 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的影響
細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)，其完整性在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)中至關(guān)重要，也是許多抑菌物質(zhì)的重要靶點(diǎn)。堿性磷酸酶（AKP）位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞壁受損時(shí)，AKP 會(huì)泄漏到細(xì)菌細(xì)胞外介質(zhì)中，造成胞內(nèi)酶含量降低，常用于反應(yīng)細(xì)胞壁完整性的變化。由圖3a 可知，AKP酶活力隨著時(shí)間和苯乳酸質(zhì)量濃度的增加而顯著減少（P ＜0.05），在48 h，2 MIC 時(shí)降至最低。結(jié)果表明，苯乳酸在一定程度上破壞了霍氏腸桿菌的細(xì)胞壁，并且受到作用時(shí)間和苯乳酸質(zhì)量濃度的影響。
圖3 苯乳酸對(duì)霍氏腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的影響
注：不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。
通過(guò)測(cè)定二乙酸熒光素（FDA）的熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞膜完整性的變化。只有活細(xì)胞根據(jù)酶活性可將非熒光FDA 主動(dòng)轉(zhuǎn)化為綠色熒光化合物，當(dāng)細(xì)胞膜完整時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出FDA熒光，而當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞，F(xiàn)DA 會(huì)從細(xì)胞內(nèi)流出，無(wú)法被檢測(cè)到。如圖3b 所示，1/2 MIC、MIC、2 MIC 處理組熒光強(qiáng)度相較于對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），且苯乳酸質(zhì)量濃度越高，熒光強(qiáng)度下降幅度越大。2 MIC 組熒光強(qiáng)度約是對(duì)照組的1/2 倍，表明此質(zhì)量濃度下細(xì)胞膜被破壞的程度最嚴(yán)重。試驗(yàn)結(jié)果表明苯乳酸有效的破壞了細(xì)胞膜的完整性。
當(dāng)細(xì)胞膜的完整性被破壞時(shí)，離子首先流出，然后是核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。因此，通過(guò)測(cè)定在波長(zhǎng)260 nm 與280 nm 波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)確定細(xì)胞中核酸與蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏情況。由圖3c 可知，在波長(zhǎng)260 nm 處胞外吸光值隨著苯乳酸處理質(zhì)量濃度的增加而增加，且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加。在48 h，經(jīng)2 MIC 苯乳酸處理后的吸光度達(dá)到最高，約是處理組的1.6 倍，表明苯乳酸處理導(dǎo)致霍氏腸桿菌核酸的泄漏。由圖3d 可知，MIC 苯乳酸組在波長(zhǎng)280 nm 處的胞外吸光值顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05），且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加，說(shuō)明苯乳酸處理導(dǎo)致霍氏腸桿菌蛋白質(zhì)的泄漏。值得注意的是，1/2 MIC 組吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著，而2 MIC 組吸光值呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，其原因可能是隨著苯乳酸處理質(zhì)量濃度的增加，溶液酸度升高，pH 值改變引起上清液中的部分蛋白質(zhì)發(fā)生沉降而導(dǎo)致含量降低。結(jié)果表明，苯乳酸處理破壞了霍氏腸桿菌細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致核酸與蛋白質(zhì)等物質(zhì)的泄漏，從而影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。
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