家兔肺支氣管敗血波氏桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定及耐藥性研究（一）
摘 要:為深入了解兔支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica, Bb),試驗(yàn)將病兔體內(nèi)分離得到的菌株進(jìn)行菌株鑒定、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、致病性研究、藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè),期望了解該菌的生長(zhǎng)規(guī)律,為臨床用藥及防控奠定基礎(chǔ)。通過(guò) Gram 染色鏡檢、分離培養(yǎng)、16S rDNA 序列分析對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定,測(cè)定了該分離株的生長(zhǎng)曲線、半數(shù)致死量、耐藥性并對(duì)分離菌株進(jìn)行 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的檢測(cè)。結(jié)果表明:分離得到 1 株革蘭氏陰性桿菌,命名為 P201215,該分離株的 16S rDNA 基因序列與 GenBank 中支氣管敗血波氏桿菌(登錄號(hào)為 NR113628.1)的同源性為 99%。分離株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為 2~9 h,9 h 后進(jìn)入平臺(tái)期;對(duì) KM 小鼠的半數(shù)致死量為 1.19×107 CFU。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株對(duì)部分頭孢菌素類(lèi)藥物耐藥,對(duì)大部分 β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)及氨基糖苷類(lèi)藥物敏感,PCR 檢測(cè)未檢出超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因。
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是革蘭陰性小桿菌,大小為 0.2~0.5 μm×0.5~2.0 μm,無(wú)芽孢。本菌能夠感染多種哺乳動(dòng)物,如豬、家兔、馬、犬等,主要引起豬萎縮性鼻炎和兔波氏桿菌病。支氣管敗血波氏桿菌感染兔后能導(dǎo)致病兔體溫升高、咳嗽、流鼻涕及突然死亡,出現(xiàn)支氣管肺炎及肺膿腫等病理變化。在養(yǎng)殖行業(yè)中,該菌常與兔巴氏桿菌、葡萄球菌等混合感染,無(wú)癥狀攜帶或有臨床癥狀均會(huì)給養(yǎng)殖者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而家兔是伴侶動(dòng)物,兔波氏桿菌病也意味著人畜共患的風(fēng)險(xiǎn)。
目前該病的治療措施以抗生素治療為主,但由于目前 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是臨床上使用最廣泛的抗生素,許多病原體對(duì) β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素已產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性,其中革蘭氏陰性桿菌對(duì)該類(lèi)藥物的耐藥率持續(xù)上升。多篇研究指出,支氣管敗血波氏桿菌對(duì)青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)藥物存在較高的耐藥性,其機(jī)制為細(xì)菌產(chǎn)生 β-內(nèi)酰胺酶水解藥物中的 β-內(nèi)酰胺環(huán)從而使藥物失活。超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamerses,ESBLs)能夠水解 β-內(nèi)酰胺酶,主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生,ESBLs 基因在質(zhì)粒介導(dǎo)下,可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種形式在細(xì)菌間擴(kuò)散,是細(xì)菌對(duì) β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性的主因。因此,檢測(cè)分離株的耐藥性及 ESBLs耐藥基因?qū)χ笇?dǎo)臨床用藥有重要意義。
試驗(yàn)所用菌株是從死亡家兔肺組織病料中分離得到,經(jīng)測(cè)序鑒定為支氣管敗血波氏桿菌,試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定,以了解其生長(zhǎng)規(guī)律。同時(shí)用分離株測(cè)定其對(duì) SPF 級(jí) KM 小鼠的半數(shù)致死量,并進(jìn)行了耐藥性和 β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè),以期為后續(xù)對(duì)本菌的深入研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
病料與試驗(yàn)動(dòng)物:病死家兔收集于某兔業(yè)合作社。SPF 級(jí) KM 小鼠,18~22 g,36 只,雌雄各半,購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。
主要試劑和儀器:LB液體培養(yǎng)基、含5%血清的TSB瓊脂培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、1 mL注射器、胎牛血清等;抗菌藥敏紙片,購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;DNA 分子量標(biāo),購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司;細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒,購(gòu)自天根生化(北京)有限公司;PCR 擴(kuò)增儀、核酸電泳儀等,購(gòu)自美國(guó)百樂(lè)公司;紫外線分光光度計(jì)、臺(tái)式冷凍離心機(jī),購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)菌的分離純化、16S rDNA 基因擴(kuò)增及序列分析
無(wú)菌采集病死動(dòng)物肺組織,連續(xù)劃線接種于含 5% 血清的 TSB 培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng) 24 h,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,觀察菌落形態(tài)及細(xì)菌大小形態(tài)。將單個(gè)菌落純化后加入甘油與生理鹽水 1∶1 體積比混勻液中,保存于-80 ℃。
用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒提取分離株 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表 1。反應(yīng)體系(20 μL):2× Taq PCR Master 10 μL,上下游引物各 1 μL,DNA 模板 1 μL,dd H2O 補(bǔ)足反應(yīng)體系至 20 μL。反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性 3 min;98 ℃變性 15 s,58 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 25 s,進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán);72 ℃額外延伸 5 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng) BLAST 比對(duì)后,篩選 14 株 GenBank 上公布的相關(guān)細(xì)菌的 16S rDNA 進(jìn)行同源性分析。利用 MEGA 7.0 軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。
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