lmo1508/lmo1509基因缺失對單增李斯特菌生長曲線、抗氧化應激能力的影響（二）
1.4 gsh-px報告質粒的構建
1.4.1 目的片段的擴增
以10403S基因組為模板，利用表2中的pFL516 A/B引物對擴增gsh-px的啟動子片段Pgsh-px；以pFL251為模板，利用pFL516 C/D引物對擴增gfp片段，PCR產物使用膠回收試劑盒進行回收純化。以上述PCR擴增獲得的Pgsh-px啟動子和gfp為模板，用pFL516 A/D引物對進行SOE-PCR獲得pFL516（Pgsh-px-gfp）目的片段，使用DNA回收試劑盒將融合片段回收備用。
1.4.2 報告質粒的構建
采用重組的方法將Pgsh-px-gfp目的片段與SalⅠ單酶切的載體質粒pERL3連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，長出菌落后挑單菌落進行PCR鑒定。將PCR鑒定陽性的克隆送至武漢擎科生物技術有限公司進行測序驗證。將測序正確的gsh-px報告基因重組質粒命名為pFL516。
1.5 熒光蛋白表達菌株的構建
提取構建成功的pFL516質粒，利用電轉化法將pFL516質粒電轉入LM菌株10403S感受態(tài)細胞中，電轉程序為：2.5 kV、400 Ω、25 μF，電擊完成后加入1 mL含0.5 mol/L蔗糖的BHI培養(yǎng)基，置于37 ℃靜置培養(yǎng)3 h后涂布于含10 μg/mL紅霉素的BHI平板，37 ℃培養(yǎng)24~48 h，挑取單菌落使用pFL516 A/D引物對進行PCR鑒定，PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.6 熒光蛋白表達觀察
取10 μL過夜培養(yǎng)的10403S-pFL516涂布到載玻片上，使用熒光顯微鏡觀察細菌GFP表達情況，同時使用未轉入pFL516的野生株10403S作為對照。另取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液后用1 mL PBS將細菌沉淀重懸，重懸完全后加入到96孔板中，每孔200 μL，3個重復，利用酶標儀檢測菌液的相對熒光單位（RFU，即熒光值）。數(shù)據(jù)結果為3個重復試驗的平均值。
1.7 gsh-px基因調控因子的篩選
將gsh-px的報告質粒pFL516電轉進TCS缺失株中，涂布于含紅霉素抗性的BHI平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24~48 h，挑取單菌落進行PCR鑒定，經凝膠電泳檢測PCR結果，獲得攜帶pFL516報告基因的菌株。通過檢測綠色熒光的強度對gsh-px基因轉錄水平進行評價，熒光值越高說明轉錄水平越高，反之則說明轉錄水平越低，以親本株10403S-pFL516為對照組。
將攜帶gsh-px報告質粒的TCS缺失株劃線于含紅霉素抗性的BHI平板上，次日挑取單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。每個菌株各取1 mL菌液于離心管中，12 000 r/min離心2 min后棄去上清液，非應激樣品用1 mL PBS將細菌沉淀充分重懸，應激樣品用5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+應激處理1 h后用1 mL PBS將細菌沉淀充分重懸，每孔200 μL，3個重復，測量細菌菌液的熒光值。試驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析并作圖。
1.8 生長曲線測定
分別從親本株10403S、缺失株Δlmo1508/lmo1509的固體平板上挑取單菌落接種于液體BHI中，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，以1∶100比例接菌至新的BHI培養(yǎng)基中，并分裝到96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，使用酶標儀測定OD600 nm值，每隔1 h測定1次，直至進入平臺期，并據(jù)此繪制出生長曲線。試驗重復3次取平均值。
1.9 氧化應激試驗
為了確定報告基因篩選出的TCS的調控作用，將pFL516報告基因熒光值顯著升高的TCS缺失株進行金屬離子氧化應激存活試驗，參考張鈺等方法進行。12 000 r/min離心2 min收集過夜培養(yǎng)的菌體，并用PBS洗滌一次，然后稀釋至OD600 nm值為0.6。將稀釋好的菌液分別加入終濃度為5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃靜置處理1 h。應激處理后10倍倍比稀釋菌液，稀釋菌液進行點板后過夜培養(yǎng)，并統(tǒng)計菌株存活率。試驗重復3次。若pFL516熒光值及5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+金屬離子氧化應激存活試驗結果均有顯著差異且結果一致時則可初步確定該TCS為GSH-Px的調控因子。
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