攜帶抗生素耐藥基因沙門菌P1噬菌體-質(zhì)粒效價(jià)、形態(tài)、一步生長(zhǎng)曲線及最適溫度（二）
1.2.3 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=噬菌體數(shù)量(plaque forming unit，PFU)/宿主菌數(shù)量(colony forming units，CFU)。不同MOI的效價(jià)最高時(shí)，即為最佳感染復(fù)數(shù)。受體菌沙門菌BYC4分別按照MOI值為：10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10混勻，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，過(guò)濾器除菌后將噬菌體10倍稀釋后，噬菌斑法測(cè)定噬菌體效價(jià)，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。
1.2.4 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定
噬菌體和受體沙門菌BYC4，按照最佳感染復(fù)數(shù)混勻。參照屈平平的研究，方法略有改動(dòng)。每隔15 min取100μL，梯度稀釋后噬菌體斑法測(cè)定其效價(jià)，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。感染時(shí)間為X軸，噬菌體效價(jià)的log值為Y軸，繪一步生長(zhǎng)曲線圖。爆發(fā)量為裂解末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度。
1.2.5 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定
P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒分別于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴，分別在30、60和90 min各取3管，稀釋后測(cè)其效價(jià)。
1.2.6 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒pH穩(wěn)定性測(cè)定
P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒分別加入900μL不同pH(2~13)的SM Buffer，37℃室溫靜置，分別30、60和90 min各取3管樣品，稀釋后測(cè)其效價(jià)。
1.2.7 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)及宿主適應(yīng)性測(cè)定
沙門菌或大腸埃希菌受體菌與噬菌體混合，涂布于含CTX 1 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基平板上。PCR的方法驗(yàn)證頭孢噻肟瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株。
轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的大腸埃希菌和沙門菌及其原菌37℃連續(xù)培養(yǎng)12 h。使用酶標(biāo)儀每隔2 h測(cè)定600 nm吸收光下細(xì)菌濃度變化。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行計(jì)數(shù)。
1.2.8 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定
轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的大腸埃希菌和沙門菌及其原菌37℃連續(xù)培養(yǎng)24 h。1∶1 000連續(xù)重復(fù)傳代30 d。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行計(jì)數(shù)。
1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
利用GraphPad prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。
2結(jié)果
2.1 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒效價(jià)
為評(píng)估沙門菌J46中P1噬菌體-質(zhì)粒能否被誘導(dǎo)并釋放出感染子代顆粒，選用噬菌體誘導(dǎo)劑絲裂霉素C，在時(shí)間維度上不同溫度條件下進(jìn)行研究。選取對(duì)數(shù)期OD600=0.5沙門菌J46四種不同溫度26℃、32℃、37℃、42℃分別連續(xù)誘導(dǎo)20 h。結(jié)果顯示，不同溫度均可產(chǎn)生感染噬菌體顆粒(圖1)。其中，溫度為37℃和42℃時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間1 h即有噬菌體產(chǎn)生，誘導(dǎo)時(shí)間在4~6 h，噬菌體效價(jià)最高，可達(dá)約106 PFU·mL-1，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，噬菌體效價(jià)緩慢下降。溫度為26℃和32℃時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間6 h時(shí)可觀察到噬菌體產(chǎn)生，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)到20 h時(shí)，其效價(jià)仍低于37℃時(shí)誘導(dǎo)的最佳效價(jià)。
圖1 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒效價(jià)
2.2 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒形態(tài)
沙門菌J46中可誘導(dǎo)P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒，由噬菌斑照片可知，P1-CTX產(chǎn)生的裂解斑塊直徑為1~2 mm，且清晰(圖2A)。P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒屬于肌病毒科，透射電鏡下可觀察到P1-CTX由頭部和尾部組成，頭部為球狀直徑約60~80 nm。尾部約為120~160 nm，且與頭部相連的尾部有髓鞘包裹，尾部可清晰地觀察到中空的尾管結(jié)構(gòu)，與已公布的標(biāo)準(zhǔn)P1噬菌體一致(圖2B)。
A.P1-CTX噬菌斑；B.透射電子顯微鏡下P1-CTX噬菌體形態(tài)
圖2 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒噬菌斑和電鏡下形態(tài)
2.3 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒最佳感染復(fù)數(shù)MOI
為檢測(cè)噬菌體P1最佳感染復(fù)數(shù)，噬菌體和受體菌共培養(yǎng)后通過(guò)噬菌斑計(jì)數(shù)試驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果如表1所示，當(dāng)P1-CT噬菌體-質(zhì)粒和受體菌比例為0.01時(shí)，為最佳感染復(fù)數(shù)，可產(chǎn)生最多的噬菌體子代，噬菌體效價(jià)為1.97×108 PFU·mL-1。隨著MOI值的降低，噬菌體效價(jià)值呈現(xiàn)明顯下降，而隨著MOI值的增大，噬菌體效價(jià)變化幅度較小，均維持在108 PFU·mL-1水平。
表1 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒最佳感染復(fù)數(shù)
2.4 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒一步生長(zhǎng)曲線
噬菌體的裂解周期，其增殖過(guò)程包括五個(gè)階段，分別為吸附、核酸注入、DNA合成、噬菌體粒子組裝和裂解細(xì)胞釋放。噬菌體的吸附、增殖和裂解可用一步生長(zhǎng)曲線描述。由圖3可以看出，P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒從吸附到裂解釋放出噬菌體顆粒的潛伏期為45 min，從檢測(cè)出噬菌體到噬菌體數(shù)量達(dá)到頂值，裂解期持續(xù)約50 min，約100 min后達(dá)到平臺(tái)期，裂解末期噬菌體數(shù)量約為1.0×108 PFU·mL-1，P1噬菌體的裂解量為63 PFU·cell-1。
圖3 P1-CTX噬菌體-質(zhì)粒一步生長(zhǎng)曲線
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