林氏扇頭蜱抗菌肽重組蛋白對(duì)大腸埃希菌生長曲線影響及抑菌效果（二）
1.2.2生物信息學(xué)分析
使用在線軟件CAMPR3（http://www.camp3.bicnirrh.res.in/prediction.php）預(yù)測Microplusin-like基因的抑菌活性；用在線軟件APD3（https://aps.unmc.edu/AP）對(duì)該基因的理化性質(zhì)包括凈電荷數(shù)、GRAVY總平均親水性和Wimley-White全殘基疏水性標(biāo)度、蛋白結(jié)合勢（Boman index）進(jìn)行計(jì)算；使用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam）預(yù)測蛋白大小及等電點(diǎn)。
1.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白表達(dá)與純化
在目的基因序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物，并添加保護(hù)堿基和XhoⅠ/XbaⅠ酶切位點(diǎn)，以1.2.1中測序正確的目的片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pCold-SUMO載體經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙酶切后，與目的基因連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成功后提取質(zhì)粒，命名為pCold-SUMO/Microplusin-like。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，平板培養(yǎng)，挑取單克隆后的菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，超聲破碎，收集上清。利用Ni-NTA Resin對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)純化情況。以帶His標(biāo)簽的鼠單抗作為一抗，HRP-山羊抗鼠作為二抗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western Blot檢測。
1.2.4重組蛋白抑菌活性測定
1.2.4.1菌懸液的制備
將甘油保存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。采用濁度儀計(jì)算菌液濃度，并調(diào)節(jié)至1×106~1×107 CFU/mL菌懸液備用。
1.2.4.2紙片擴(kuò)散法測定抗菌活性
采用濾紙片擴(kuò)散法，在空白濾紙片上滴加30μL重組蛋白（濃度為10 mg/mL），用無菌鑷子貼在含菌平板上，以SUMO空載蛋白及無菌水濾紙片作為陰性對(duì)照，以滴加20μL卡那霉素（濃度為50 mg/mL）濾紙片作為陽性對(duì)照，37℃恒溫倒置培養(yǎng)16 h后，觀察記錄抑菌圈的有無，采用十字交叉法，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，取平均值作為測定結(jié)果。結(jié)果判定參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑<10 mm為抗藥、10 mm為輕度敏感、11~15 mm為中度敏感、16~20 mm為高度敏感。
1.2.4.3最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）測定
參考美國臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的方法，并稍作修改，測定重組蛋白的MIC和MBC。采用微量肉湯稀釋法，在96孔板中進(jìn)行試驗(yàn)。向A行和B行的第2~12孔各加入100μL MH液體培養(yǎng)基。在第1孔中加入100μL重組蛋白溶液，第2孔加入100μL重組蛋白后，逐孔進(jìn)行對(duì)倍稀釋，直至第12孔，棄去100μL。隨后，向A行第1~12孔各加入100μL菌懸液，作為試驗(yàn)組。向B行第1~12孔各加入100μL MH液體培養(yǎng)基，作為陰性溶劑對(duì)照組。向C行各孔加入100μL MH液體培養(yǎng)基和100μL菌懸液，用于驗(yàn)證培養(yǎng)基是否支持菌株正常生長，作為陽性生長對(duì)照組。向D行各孔加入200μL MH液體培養(yǎng)基，用于檢測培養(yǎng)基是否被污染，作為空白對(duì)照組。將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，觀察結(jié)果。陽性孔呈現(xiàn)渾濁，表明細(xì)菌正常生長；陰性孔和空白孔保持清亮，表明試驗(yàn)過程無污染。試驗(yàn)組中無肉眼可見菌體生長的最低藥物濃度即為MIC。確定MIC后，取濃度≥MIC的菌懸液涂布于MH瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，菌落數(shù)≤5時(shí)的最低藥物濃度即為MBC。
1.2.4.4重組蛋白對(duì)大腸埃希菌生長曲線、時(shí)間殺菌曲線的影響
選擇大腸埃希菌ATCC25922作為指示菌，取菌懸液與重組蛋白混合，使其終濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC，不加重組蛋白的樣品作為空白生長對(duì)照組，37℃孵育12 h，每小時(shí)使用酶標(biāo)儀測量1次OD600 nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600 nm為縱坐標(biāo)繪制大腸埃希菌生長曲線。
取2 mL菌懸液至無菌試管，分別加入重組蛋白，使其終濃度為0 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC，置于37℃下孵育，分別于0、5、15、30、60、120 min取100μL菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于MH瓊脂平板，37℃孵育24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落形成單位數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制大腸埃希菌時(shí)間-殺菌曲線。
1.2.5重組蛋白抗菌機(jī)制研究
1.2.5.1掃描電子顯微鏡分析
使用1 MBC濃度的重組蛋白處理大腸埃希菌為試驗(yàn)組，使用等體積PBS處理指示菌為空白對(duì)照組。37℃孵育1 h，將孵育后的菌液離心收集菌體細(xì)胞，PBS沖洗3次，向菌體沉淀中加入2.5%戊二醛，重懸菌體，4℃固定過夜，接著用乙醇脫水15 min，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥儀充分干燥后，使用離子濺射儀噴金，通過掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察。
1.2.5.2透射電子顯微鏡分析
透射電鏡的制樣程序前期與掃描電鏡相同，2.5%戊二醛溶液固定后，用1%鋨酸固定液固定2 h，PBS洗滌3次后，使用丙酮對(duì)樣品進(jìn)行脫水，包埋切片后用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，通過透射電鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察。
1.2.5.3林氏扇頭蜱Microplusin-like蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測與分子對(duì)接
利用AlphaFold工具構(gòu)建多肽的三維結(jié)構(gòu)模型，并通過在線平臺(tái)SAVES（https://saves.mbi.ucla.edw）對(duì)模型進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和可靠性，選擇最優(yōu)模型。選擇E.coil外模脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的X衍射晶體結(jié)構(gòu)（PDB代碼為4RHB），利用指示菌蛋白結(jié)構(gòu)作為受體，AlphaFold工具構(gòu)建的林氏扇頭蜱Microplusin-like蛋白三維結(jié)構(gòu)作為配體，使用Hdock進(jìn)行分子對(duì)接。共采集100個(gè)對(duì)接構(gòu)象；參照對(duì)接得分進(jìn)行構(gòu)象排序挑選出10個(gè)分?jǐn)?shù)靠前的構(gòu)象，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)選取最優(yōu)構(gòu)象。對(duì)接結(jié)果通過Pymol進(jìn)行3D可視化分析，使用Ligplus軟件進(jìn)行2D可視化分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有試驗(yàn)平行3次，應(yīng)用GraphPad 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析并繪圖，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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