烏梅等20種中藥的體外抗胸膜肺炎放線桿菌活性研究【?藥敏試驗(yàn)】（一）
【目的】觀察烏梅Fructus mume等20種中藥的體外抗胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通過(guò)乙醇回流、水煎煮和超聲波等方法對(duì)20種中藥進(jìn)行提取，采用二倍稀釋法測(cè)定其對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性;并研究抗菌活性較強(qiáng)的幾味中藥的體外聯(lián)合抑菌活性.【結(jié)果和結(jié)論】烏梅、黃連Rhizoma coptidis、訶子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6種中藥提取物對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)范圍是6.25～50.00 mg/mL;大青葉Isatis indigotica、茵陳Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鮮皮Dictamnus dasycarpus 4種中藥提取物的MIC范圍是50.00～100.00 mg/mL;黃柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金銀花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板藍(lán)根Baphicacanthus cusia、梔子Gardenia jasminoides和黃芪Astragalus membranaceus等10種中藥提取物的MIC＞100.00 mg/mL.聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)≤1，烏梅、虎杖分別與秦皮的FICI＞2.烏梅、黃連、訶子、虎杖、秦皮、地榆對(duì)胸膜肺炎放線桿菌均具有較好的體外抗菌活性;烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯(lián)合為相加、協(xié)同作用;秦皮分別與烏梅、虎杖為拮抗作用.
胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，后根據(jù)其表型和DNA雜交水平均與放線桿菌屬模式種密切相關(guān)，歸屬為巴氏桿菌科放線桿菌屬.常與巴氏桿菌等混合感染，是引起豬上呼吸道感染的主要病原菌之一.主要引起豬傳染性胸膜肺炎，表現(xiàn)為急慢性炎癥，急性死亡率較高，常伴隨豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染，是一種高度傳染性疾病.目前豬傳染性胸膜肺炎的治療主要采用抗菌藥物，如氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星等，大量抗菌藥物的使用，增加了胸膜肺炎放線桿菌的耐藥性，同時(shí)由于抗菌藥物的濫用，造成藥物殘留和環(huán)境污染等諸多社會(huì)問(wèn)題.針對(duì)抗菌藥物所帶來(lái)的諸多問(wèn)題，獸醫(yī)臨床急需尋找低毒有效的抗菌藥物替代品，以控制疾病的發(fā)生.據(jù)研究報(bào)道，中藥或天然植物提取物，可發(fā)揮對(duì)病原菌的直接殺滅作用不產(chǎn)生耐藥性.因此如何從中藥中尋找抗胸膜肺炎放線桿菌新藥已經(jīng)成為藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn).本研究選擇烏梅、黃連等20種具有抗菌活性的中藥，提取其不同部位，研究其對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性，以期為篩選得到對(duì)胸膜肺炎放線桿菌具有抗菌作用的中藥及其復(fù)方奠定基礎(chǔ).
1材料與方法
1.1材料
烏梅Fructus mume(產(chǎn)地四川，批次：120315)、黃連Rhizoma coptidis(產(chǎn)地四川，批次：080406)、訶子Terminalia chebula(產(chǎn)地云南，批次：081121)、虎杖Polygonum cuspidatum(產(chǎn)地四川，批次：081102)、柴胡Bupleurum chinense(產(chǎn)地甘肅，批次：080301)、板藍(lán)根Baphicacanthus cusia(產(chǎn)地甘肅，批次：080921)、黃柏Phellodendron amurense(產(chǎn)地四川，批次：080923)、大青葉Isatis indigotica(產(chǎn)地四川，批次：100310)、杜仲Eucommia ulmoides(產(chǎn)地云南，批次：080916)、蒲公英Taraxacum mongolicum(產(chǎn)地貴州，批次：100217)、白鮮皮Dictamnus dasycarpus(產(chǎn)地遼寧，批次：080914)、茵陳Artemisia capillaris(產(chǎn)地河北，批次：080923)、秦皮Cortex fraxini(產(chǎn)地山西，批次：100330)、梔子Gardenia jasminoides(產(chǎn)地廣西，批次：080622)、黃芪Astragalus membranaceus(產(chǎn)地陜西，批次：040824)、魚(yú)腥草Houttuynia cordata(產(chǎn)地四川，批次：100310)、甘草Glycyrrhiza uralensis(產(chǎn)地甘肅，批次：081102)、夏枯草Prunella vulgaris(產(chǎn)地河南，批次：101114)、地榆Sanguisorbae officinalis(產(chǎn)地陜西，批次：040827)、金銀花Lonicera japonica(產(chǎn)地四川，批次：080919)20種中藥均購(gòu)于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)系副教授范巧佳鑒定為正品.
胸膜肺炎放線桿菌(ATCC265)，購(gòu)買于中國(guó)獸藥監(jiān)察所.含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%煙酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)的TSB液體培養(yǎng)基、含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%NAD的TSA固體培養(yǎng)基.96微孔細(xì)胞培養(yǎng)板、SPX型生化培養(yǎng)箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器等.
1.2方法
1.2.1 20種中藥有效部位的提取烏梅、黃連、訶子、虎杖等20種中藥按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行有效部位的提取，壓縮烘干成浸膏.
1.2.2藥液制備將20種中藥提取物浸膏溶于二甲基亞砜中，配制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的儲(chǔ)備液，高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存.
1.2.3有效部位抗菌活性研究參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推薦的對(duì)細(xì)菌敏感性檢測(cè)方案，采用試管二倍稀釋法，測(cè)定20種中藥有效部位提取物對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC);用TSA瓊脂平板涂板法測(cè)定20種中藥有效部位提取物對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的最小殺菌濃度(Minimal bactericidal concentration，MBC).
菌液制備：采用平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌液濃度.將胸膜肺炎放線桿菌菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取不同稀釋度的菌液0.1 mL滴加于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%NDA的TSA平板上，用無(wú)菌涂布器涂布均勻，每稀釋度重復(fù)2塊平板，37℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h.選取菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組稀釋度相同的平板取平均值作為菌落數(shù).計(jì)算出原菌液細(xì)菌濃度，作為細(xì)菌菌液的標(biāo)準(zhǔn)濃度.
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