什么是不可培養(yǎng)微生物？原因是什么
環(huán)境中存在的微生物估計(jì)達(dá)到105～106種，但在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基中可分離鑒定的種類數(shù)量較少。國(guó)際原核生物分類學(xué)委員會(huì)證實(shí):自從平板培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用以來，發(fā)現(xiàn)的原核種類只有7 031種。這種差別可能是由于許多微生物的不同生長(zhǎng)狀態(tài)比如休眠期不能根據(jù)培養(yǎng)基成分的變化及時(shí)調(diào)整自身生長(zhǎng)，導(dǎo)致在平板中無法計(jì)數(shù)。放射自顯影技術(shù)及直接活菌計(jì)數(shù)都表明平板中50%甚至90%的細(xì)菌細(xì)胞保持代謝活性，但卻不能在固體培養(yǎng)基上形成菌落，從表觀上認(rèn)為這類微生物是不可培養(yǎng)的微生物。不可培養(yǎng)微生物是一個(gè)巨大的微生物資源庫，其中蘊(yùn)藏著豐富的新基因。對(duì)其進(jìn)行深入研究可充分認(rèn)識(shí)微生物物種的多樣性，了解生物進(jìn)化及微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)信息。研究不可培養(yǎng)微生物的代謝多樣性可發(fā)現(xiàn)新的代謝途徑和新的代謝產(chǎn)物。不可培養(yǎng)微生物的研究開拓了微生物學(xué)研究的新領(lǐng)域，不僅在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有意義，同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的物種、新的基因和新的代謝產(chǎn)物，將對(duì)發(fā)現(xiàn)新化合物特別是新藥開發(fā)具有積極意義。
1、微生物不可培養(yǎng)的原因及限制因子
1.1部分微生物生長(zhǎng)緩慢，尚沒有敏感檢測(cè)技術(shù)
自然環(huán)境中許多微生物都聚集生長(zhǎng)，適合實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的微生物快速繁殖，大量攝取了培養(yǎng)基中有限的營(yíng)養(yǎng)成分，從而使生長(zhǎng)緩慢的微生物得不到充足的營(yíng)養(yǎng)使生長(zhǎng)受到抑制;某些微生物即使能夠在低濃度營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但在特定的培養(yǎng)條件下不能長(zhǎng)成肉眼可見的菌落;還有一類生存在寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下的微生物在平板培養(yǎng)基中不形成菌落，而是在表面擴(kuò)散生長(zhǎng)，僅形成幾個(gè)細(xì)胞組成的小型集合;此外，衡量微生物生長(zhǎng)狀況的常規(guī)方法比如比濁法和計(jì)數(shù)法等都不能檢測(cè)到這些微生物，表觀上被認(rèn)為“不可培養(yǎng)”?，F(xiàn)在比較成熟的是用微毛細(xì)管或光學(xué)鑷子進(jìn)行的單細(xì)胞分離技術(shù)，這種方法可以從微生物群落中鑒定出目的細(xì)胞。這種技術(shù)需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件，同時(shí)由于對(duì)目的細(xì)胞的代謝認(rèn)識(shí)不足，以致于無法掌握適宜它們生長(zhǎng)的決定因子。另一方面，由于缺乏清晰直接的形態(tài)學(xué)特征也很難在一個(gè)復(fù)雜的微生物群體中鑒定出需要的目的細(xì)胞。分子生態(tài)學(xué)和宏基因組學(xué)顯著增加了對(duì)遺傳多樣性的認(rèn)識(shí)，但這些技術(shù)并不能完全檢測(cè)編碼微生物生命的整個(gè)遺傳多樣性的內(nèi)容。
1.2培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)比較豐富
自然界中可以利用高濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的微生物很少，大多數(shù)微生物處于“貧營(yíng)養(yǎng)”生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中通常將需要貧營(yíng)養(yǎng)的微生物置于豐富的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，微生物早期會(huì)快速生長(zhǎng)，但同時(shí)產(chǎn)生大量的、微生物自身難以調(diào)節(jié)的過氧化物、超氧化物或羥基自由基等“毒性氧物質(zhì)”，該類物質(zhì)快速、過量的積累會(huì)破壞微生物細(xì)胞的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，由此產(chǎn)生一些應(yīng)激機(jī)制如SOS來修復(fù)微生物，未及時(shí)修復(fù)的微生物將會(huì)死亡或表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。
1.3忽視了環(huán)境中微生物之間的相互作用
自然環(huán)境中微生物之間的相互關(guān)系非常復(fù)雜。共生是至少有一個(gè)群體為另一個(gè)群體提供其必需的生長(zhǎng)因子從而使微生物群體獲利。當(dāng)它們之間的距離靠近，本來不能生長(zhǎng)的微生物得到另一類微生物提供的生長(zhǎng)因子變得可以生長(zhǎng)，而當(dāng)微生物之間距離較遠(yuǎn)或不存在時(shí)則互不干擾或者干擾程度較低導(dǎo)致這些微生物不可培養(yǎng)。另一種關(guān)系是群體感應(yīng)。它是微生物間通過感應(yīng)一種信號(hào)分子來判斷群體密度和環(huán)境的變化，啟動(dòng)相應(yīng)的基因作出協(xié)調(diào)統(tǒng)一的應(yīng)答，從而調(diào)節(jié)群體的生長(zhǎng)。當(dāng)微生物的群體密度較低時(shí)，自身誘導(dǎo)素合酶基因產(chǎn)生一個(gè)基礎(chǔ)水平表達(dá)，引起自身誘導(dǎo)信號(hào)產(chǎn)生，這些信號(hào)在細(xì)胞外擴(kuò)散并且立即在周圍環(huán)境中被稀釋。而群體密度不斷上升，引起自身誘導(dǎo)素在細(xì)胞周圍不斷積累，激活特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白抑制它的活性，致使微生物其他表型的活化。微生物之間還存在其他類型的關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，單純地將待培養(yǎng)的微生物與其他相關(guān)的微生物群體分開，物種之間的信息交流被阻斷，微生物因缺乏必需的生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子而無法生長(zhǎng)，表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。
1.4缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，在實(shí)驗(yàn)室條件下無法實(shí)現(xiàn)原位培養(yǎng)
微生物的生存環(huán)境和自然條件相當(dāng)復(fù)雜，比如:微生物的多樣性、自然環(huán)境中的化學(xué)因素、環(huán)境中生物與非生物因素之間的相互作用以及微生物水平上的全球生態(tài)系統(tǒng)的平衡等。因此，沒有或無法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常只是將培養(yǎng)條件進(jìn)行改善，如將微生物置于恒溫、恒定轉(zhuǎn)速、黑暗的環(huán)境中;將微生物限制在固體培養(yǎng)基或不攪動(dòng)的液體介質(zhì)中;替換微生物的營(yíng)養(yǎng)組分或者缺少某種化學(xué)因子等。對(duì)微生物培養(yǎng)條件的認(rèn)識(shí)需要逐漸探索，如在培養(yǎng)Spirochaetes(螺旋體)的培養(yǎng)基中一直添加能夠使固氮酶失活的微量鎢元素，然而最近發(fā)現(xiàn)它也能夠在鎢缺少的培養(yǎng)基中通過固氮的方式生長(zhǎng)。此外，自然界中大部分微生物以群體的形式生長(zhǎng)來交換中間代謝產(chǎn)物和信號(hào)分子，因此在實(shí)驗(yàn)室中無法模擬原位生長(zhǎng)的群體培養(yǎng)。
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