生食大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌分離純化、菌落總數(shù)、生長曲線及形狀鑒定（一）
摘要：為了探究大眼金槍魚(Thunnus obesus)生魚片中生物胺產(chǎn)生菌的產(chǎn)胺特性,從市售大眼金槍魚生魚片中分離出9株生物胺產(chǎn)生菌的單菌落并確定其生長曲線,采用高效液相色譜法分析了菌株發(fā)酵液中生物胺的濃度。結(jié)果表明,9株菌株為嗜溫菌,適宜環(huán)境下均可產(chǎn)生色胺、腐胺和尸胺。篩選出3株生物胺產(chǎn)量較高的菌株,通過單菌落接種于TSB培養(yǎng)基培養(yǎng),3 d累積產(chǎn)生生物胺的質(zhì)量濃度分別為40.4、41.3和50.3 mg/L。將產(chǎn)胺量較高的菌株進(jìn)行VITEK 2和16S r DNA鑒定,3株菌株分別為溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus),產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究如何抑制大眼金槍魚中生物胺的產(chǎn)生提供了理論依據(jù),也為大眼金槍魚的保藏研究奠定了理論基礎(chǔ)。
大眼金槍魚(Thunnusobesus)又稱肥壯金槍魚，屬鱸形目鯖科，大洋性洄游魚類，分布于印度洋、大西洋、太平洋和南海外海等地。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，不僅富含蛋白質(zhì)，還含有DHA和EPA等不飽和脂肪酸，食用和商用價值極高。據(jù)最新國際漁業(yè)動態(tài)報道，隨著金槍魚市場價格不斷走高，捕撈量也在大幅提高。
目前，國內(nèi)市售大眼金槍魚占有市場比例較高，由于其屬于紅肉魚類，在加工和流通過程當(dāng)中，如果加工和貯藏不當(dāng)，容易造成生物胺超標(biāo)。生物胺是一種低分子量的堿性含氮化合物，廣泛存在于蛋白質(zhì)及氨基酸含量豐富的水產(chǎn)品中，主要通過微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶分解游離氨基酸產(chǎn)生。食用生物胺超標(biāo)水產(chǎn)品，易引起人體中毒，近些年來因食用金槍魚而發(fā)生的生物胺中毒事件時有發(fā)生。國內(nèi)對于生食金槍魚已經(jīng)有了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其中組胺不得超過90 mg/kg。
國內(nèi)外對水產(chǎn)品中生物胺產(chǎn)生菌已經(jīng)有了相關(guān)研究，常見的有弧菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、乳酸菌、腸桿菌等，除此之外一些新的菌群也被證實可產(chǎn)生生物胺，如沙門菌群、巴斯德菌和根瘤菌等不同菌科。目前，大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌的相關(guān)研究鮮有報道。本文將大眼金槍魚的生魚片作為研究對象，通過微生物分離結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，篩選出了生物胺產(chǎn)生菌，再利用表型特征鑒定和基因型鑒定相結(jié)合的方法，確定了菌株的種類，以期為生食大眼金槍魚肉中生物胺的控制提供理論參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
大眼金槍魚，購于廣州市沛洋食品有限公司(-60℃凍藏)。
腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯(純度≥98%)，美國Sigma公司；NaCl、NaOH、NaHCO3、NH3·H2O，廣州粵升化學(xué)試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、L-組氨酸、色氨酸、酪氨酸、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth，TSB)，廣州市普博儀器有限公司；乙睛(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水，實驗室自制。
1.2儀器與設(shè)備
LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津SHINADZU公司；CX41顯微鏡，日本OLYMPUS公司；MILLI-Q超純水機，美國Millipore公司；3K30高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；SPX-500智能生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TU-1990紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；oCelloScope微生物生長監(jiān)測系統(tǒng)，法國梅里埃公司；DYY-7B電泳儀，北京六一儀器廠。
1.3實驗方法
1.3.1樣品制備
將金槍魚在無菌環(huán)境下解凍后置于0℃下貯藏備用。
1.3.2菌落總數(shù)和K值的測定
參考GB4789.2—2016的方法，測定0℃貯藏的大眼金槍魚中的菌落總數(shù)。
參考SC/T 3048—2014的方法，測定0℃貯藏的大眼金槍魚中K值變化。K值計算如公式(1)所示：
式中：ATP為腺苷三磷酸濃度、ADP為腺苷二磷酸濃度、AMP為腺苷酸濃度、IMP為肌苷酸濃度、HxR為次黃嘌呤核苷濃度、Hx為次黃嘌呤濃度，單位均為μmol/g。
1.3.3培養(yǎng)基配制
生物胺篩選培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、瓊脂20、溴甲酚紫0.06、L-組氨酸2、色氨酸2、酪氨酸2，1 mol/L HCl調(diào)pH至5.3±0.2。
TSA培養(yǎng)基(g/L)：取47 g TSA于1 L蒸餾水中滅菌，制成平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基。
TSB培養(yǎng)基：取TSB 3 g、L-組氨酸0.03 g、色氨酸0.03 g、酪氨酸0.03 g于100 mL蒸餾水中滅菌。
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