工程菌大腸桿菌EcN FGF19-01培養(yǎng)、生長曲線測定及改善慢性結(jié)腸炎作用研究（二）
6、蛋白質(zhì)提取和免疫印跡
菌體蛋白提?。喝∵m量菌液，離心后分別收集菌液和上清培養(yǎng)基，在菌液中加適量體積的混有蛋白酶抑制劑和磷脂酶抑制劑的變性RIPA裂解液（150 mM NaCl、10 mM TrispH7.2、0.1%SDS、1%Triton X-100、1%Deoxycholate和5 mM EDTA），冰浴下超聲破碎10s/10s，10 min后，4℃，12000 rmp離心20分鐘，取上清，得到菌體蛋白溶液。
培養(yǎng)基上清蛋白提取：取適量培養(yǎng)基上清，加入4倍體積的甲醇，混合均勻后4℃靜置3 h，4℃，10000 rmp離心10分鐘后棄上清，收集蛋白沉淀，將沉淀的蛋白用鹽酸胍乙醇溶液洗3次，20 min/次，使用含有蛋白酶抑制劑的1%SDS溶液溶解蛋白，得到培養(yǎng)基上清蛋白溶液。
Western blot：用Pierce公司的BCA Kit測蛋白濃度。測完濃度后，加5×SDSloading buffer（200 mM Tris-Cl、pH6.8、8%SDS、0.4%溴酚藍(lán)、40%甘油和400 mMDTT），100℃煮10分鐘，立即上樣進(jìn)行免疫印跡檢測或-20℃貯存?zhèn)溆谩?
選用10%的不連續(xù)變性聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）進(jìn)行垂直電泳，開始以80伏的電壓進(jìn)行電泳，待染料前沿進(jìn)入分離膠后將電壓提高到120伏繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部（10×電泳液：Tris 30 g、Glycine 144 g、SDS 10 g，加ddH2O到1 L）。PVDF膜用甲醇泡15 sec，和膠一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min（10×轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris 30 g、Glycine 144 g、甲醇200 ml，加水到1 L）；然后按照陽極－海綿－濾紙－PVDF膜－膠－濾紙－海綿－陰極的順序安置好，放入轉(zhuǎn)膜容器中，4℃，380 mA，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)分子量不同而不同，一般為1-2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，標(biāo)好方向和marker，按需裁剪。用10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗三次，每次10 min（10×TBS：24.2 g Tris、80 g NaCl，用濃HCl調(diào)pH到7.6；TBST：1×TBS和0.1%Tween-20）。進(jìn)行一抗反應(yīng)，抗體配置在1×TBST＋5%BSA中，室溫1-2小時或4℃過夜，回收抗體，4℃保存。PVDF膜接下來繼續(xù)用TBST洗三次，每次10 min，進(jìn)行二抗反應(yīng)，室溫一小時后TBST洗膜三次，每次10 min。ECL(AmershamBiosciences)顯影。anti-FGF19和anti-GAPDH一抗抗體均購自Cell SignalingTechnology公司。結(jié)果顯示，在無氧條件下EcN FGF19-01菌株顯著高表達(dá)FGF19蛋白。
7、Elisa試劑盒測定FGF19蛋白含量
細(xì)菌上清液FGF19含量測定：細(xì)菌經(jīng)37度水浴解凍活化后，1:100接種后過夜搖菌，第二天1:100接種到EP管中，在厭氧條件下振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10和12h時收集培養(yǎng)基，離心后取上清液，按照Elisa試劑盒（proteintech，Human FGF19 ELISA Kit，KE00243）說明書測標(biāo)準(zhǔn)品及菌液上清的FGF19蛋白含量。結(jié)果顯示，EcN FGF19-01能夠分泌FGF19蛋白至培養(yǎng)基上清中，且在6h時分泌量最高（超過8 ng/ml）。
8、工程菌EcN FGF19-01微膠囊的制備
微膠囊是由藻酸鹽-多聚賴氨酸-藻酸鹽組成的，其制備步驟如下：1）設(shè)備連接。反應(yīng)容器中注入225 ml的無菌聚合緩沖液，然后將其固定在工作臺上的微膠囊造粒儀控制單元上，并在控制單元上設(shè)置參數(shù)（振動頻率為1300Hz，電壓為1100v，轉(zhuǎn)速為75 rmp）；2）細(xì)菌收集。5x109 CFU/mL的EcN FGF19和野生型EcN菌液各20 mL，離心后棄上清，并用PBS洗兩遍后離心收集菌體在50 mL的離心管中。收集好的菌液用1mL無菌的MPOS（3-嗎啉丙磺酸）清洗緩沖液進(jìn)行重懸，然后加入20 mL1.5%的海藻酸鈉溶液混合形成細(xì)胞-藻酸鹽懸浮液；3）液珠固化。細(xì)胞-藻酸鹽懸浮液轉(zhuǎn)移至20 mL注射器中，并將其連接到層流空氣罩中的反應(yīng)容器中，然后推動注射器，懸浮液隨即進(jìn)入噴嘴，使用設(shè)定的參數(shù)使由噴嘴噴出的液滴快速分散開并進(jìn)入聚合溶液中，攪拌使液珠成形；4）藻酸隔膜形成。
在液珠固化5 min后，停止攪拌并排凈聚合溶液，然后加入75 mL 0.1%多聚賴氨酸溶液攪拌10 min；5）清洗。排凈0.05%多聚賴氨酸溶液之后，第一次清洗即加入200 mL MPOS清洗溶液攪拌1min后排凈，然后進(jìn)行第二次清洗即加入200 mL MPOS清洗溶液攪拌5 min后排凈；6）外部藻酸鹽隔膜形成。加入100 mL 0.03%藻酸鹽溶液，攪拌5 min后形成外部藻酸鹽隔膜，然后排凈藻酸鹽溶液；7）清洗。加入200 mL MPOS清洗溶液攪拌1min后排凈；8）解聚。加入200 ml解聚合溶液攪拌約10min使液珠芯材的藻酸鹽溶解，然后排凈解聚合溶液；9）膠囊收集。加入200 mL MPOS清洗溶液，重新懸浮膠囊并傳送至收集瓶進(jìn)行收集。微膠囊分別命名為EcN FGF19-01和EcN WT。
9、實(shí)驗(yàn)動物處理
野生型雄性C57BL/6小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠適應(yīng)7天后，開始給予含Abx的飲用水，5天后換為正常飲水，稱體重后，將小鼠分為體重相當(dāng)?shù)?組，實(shí)驗(yàn)組開始飲用3.5%DSS水溶液，并開始分別灌胃有活性的EcN FGF19-01菌和EcN WT菌（1*109 CFU/小鼠），或分別灌胃EcN FGF19-01和EcN WT微膠囊，每只小鼠灌胃200μL菌液或微膠囊，每天灌胃1次，持續(xù)1周。實(shí)驗(yàn)過程中每天稱小鼠體重，并進(jìn)行腹瀉評分（0-4）。小鼠養(yǎng)于SPF級動物房，飼養(yǎng)溫度為25℃晝夜12小時循環(huán)，實(shí)驗(yàn)開始之前給予符合國際標(biāo)準(zhǔn)的食物及飲水飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠用二氧化碳處死，收集各種組織，液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。結(jié)果顯示，灌胃工程化大腸桿菌EcN FGF19-01或包裹EcN FGF19-01的微膠囊均夠顯著改善結(jié)腸炎小鼠體重、降低腹瀉指數(shù)和腸道黏膜損傷。
10、組織學(xué)分析和評分
伊紅和蘇木素（Hematoxylin and eosin,H＆amp;E）染色采用標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，對腸道形態(tài)進(jìn)行組織學(xué)分析，然后對腸道受損情況進(jìn)行雙盲評分。
11、統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組間差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用非配對組間雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行檢測，兩組以上統(tǒng)計(jì)采用one-way或two-way ANOVA分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
綜上所述，創(chuàng)制一株表達(dá)分泌FGF19工程化大腸桿菌，同時探索其在改善結(jié)腸炎中應(yīng)用價(jià)值。
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