轉(zhuǎn)錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達(dá)調(diào)控——材料與方法
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
伯氏致病桿菌Xenorhabdus bovienii NN6菌株是本實(shí)驗(yàn)室從斯氏線蟲Steinernema oregonense侵染致死的大臘螟血腔中分離鑒定的，菌種保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱中。尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusariurn oxysporum f. sp. niveum)的1號(hào)生理小種，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所瓜類組提供。NBTA鑒別培養(yǎng)基:酵母提取物3 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)20 g·L-1，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)0.1 g·L-1，溴百里酚藍(lán)(BTB)0.025 g·L-1，丙酮酸鈉(SP)1 g·L-1。LB+SP液體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，丙酮酸鈉(SP)1 g·L-1。YSG液體培養(yǎng)基:甘油6.9 g·L-1，大豆蛋白胨25.17 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.57 g·L-1，(NH4)2SO4 2.55 g·L-1，KH2PO4 0.87 g·L-1，K2HPO4 1.11 g·L-1，Na2SO4 1.81 g·L-1。馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂15～18 g·L-1。PSA培養(yǎng)基:馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基粉末46 g·L-1。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 共生菌的活化與發(fā)酵生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
從-80 ℃超低溫冰箱取出菌種在NBTA平板上劃線培養(yǎng)，72 h后接種藍(lán)綠色單菌落于LB+SP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1活化12 h。將活化好的菌液以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加入200 mL YSG培養(yǎng)基(1 L容積錐形瓶)，28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)84 h。每4 h取1次樣，每次吸取1 mL菌液加入比色皿中，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液D600值，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，每12 h測(cè)1次D600值，連續(xù)測(cè)量84 h，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液的D600值為縱坐標(biāo)。取各時(shí)間段的新鮮菌液1 mL，分別稀釋10、102、103、104、105、106、107，從稀釋好的菌液中吸取200 μL菌液到NBTA培養(yǎng)基，用玻璃棒涂布均勻后倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，待平板長(zhǎng)出菌落，開始計(jì)數(shù)。每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次。
1.2.2 胞外粗蛋白的制備
使用硫酸銨沉淀法沉淀粗蛋白，將硫酸銨固體研磨成粉末，加入待沉淀溶液中，至硫酸銨飽和度分別達(dá)到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%。4 ℃靜置6 h，12 000 r·min-1離心20 min，得到的蛋白沉淀利用緩沖液復(fù)溶后透析除鹽，供后續(xù)試驗(yàn)使用。
1.2.3 細(xì)菌總RNA提取、質(zhì)量檢測(cè)和測(cè)序文庫構(gòu)建
分別取1 mL不同發(fā)酵時(shí)間的新鮮菌液，加入1.5 mL滅菌離心管中，4 ℃、8 000 r·min-1離心20 min去除上清液。將離心管插入液氮中速凍。每個(gè)樣品重復(fù)收集3份保存于-80 ℃冰箱。樣品在液氮中充分研磨破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，加入700 μL Trizol充分混合，劇烈振蕩，靜置5～15 min。加入200 μL氯仿(除去蛋白)劇烈振蕩，靜置5 min。4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。小心吸取600 μL上清液(不能吸到中間層蛋白)，加入等體積異丙醇(沉淀RNA)緩慢搖勻，-20 ℃靜置30 min。離心機(jī)4 ℃預(yù)冷，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入400 μL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇顛倒4次清洗，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，離心管傾斜放在超凈臺(tái)吹干，每管加入40 μL RNAase free H2O振蕩搖勻，10 000 r·min-1 離心3 min。通過微量分光光度計(jì)NanoDrop測(cè)定RNA溶液的濃度和純度。將提取的RNA迅速放置液氮中冷凍，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成測(cè)序和文庫構(gòu)建，并使用Illumina測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
1.2.4 內(nèi)參引物和qPCR引物設(shè)計(jì)
內(nèi)參基因選擇16S rRNA和ropB，利用Primer-BLAST軟件，設(shè)計(jì)引物序列。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。內(nèi)參引物序列見表1。
表1 RT-qPCR內(nèi)參引物序列
1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析和差異表達(dá)基因的篩選
測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至National Center Biotechnology Information(NCBI)的SRA數(shù)據(jù)庫(查詢號(hào):PRJNA1047324)。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Novaseq6000，利用Hisat 2軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì); 采用fastp軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理，并對(duì)整個(gè)質(zhì)控過程中的reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總。采用DESeq篩選差異表達(dá)基因。
1.2.6 差異表達(dá)基因的GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析
富集分析采用BLAST2GO和topGOR包進(jìn)行GO功能分析，得到所有顯著性差異基因、上調(diào)差異基因以及下調(diào)差異基因富集的功能模塊并繪圖; 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異蛋白編碼基因進(jìn)行pathway分析(結(jié)合KEGG注釋結(jié)果)，并用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算每個(gè)pathway條目中差異基因富集的顯著性。
1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR分析
選取部分基因通過Real-time PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ATG巨匠)對(duì)1.2.3節(jié)中獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA采用核酸定量?jī)xThermo Scientific NANO-Drop1000(NanoDrop Technologies，USA)進(jìn)行定量，Real-time PCR靶標(biāo)基因和所用引物見表2。在RNase-free離心管中配制如下混合液:RNase Free ddH2O、4 × gDNA wiper Mix、RNA template混合，用移液器輕輕吹打混勻，42 ℃加熱2 min去除模板中的DNA。5 × ATGScriptTM RT Mix與反應(yīng)液混合成20 μL反應(yīng)體系，50 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)2 min。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。
表2 RT-qPCR引物序列
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與相關(guān)性分析
使用Prism 8.0(Graphpad)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Student's t-test檢驗(yàn)， P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS Statistics 26進(jìn)行變量間相關(guān)性分析。兩變量間相關(guān)性以Pearson相關(guān)系數(shù)r表示。
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