基于革蘭氏陽性菌生長曲線等指標評價纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（五）
2.5 M-MCC對細胞膜通透性的影響
如圖9所示，與未處理的L.monocytogenes組相比，在1 MIC處理下，胞外電導率呈現(xiàn)上升的趨勢，這種情況在2 MIC處理下表現(xiàn)得更加明顯。這是因為活的細菌細胞擁有完整的細胞膜，能夠選擇性的控制膜內(nèi)外的物質(zhì)跨膜運輸，所以胞外電導率較為穩(wěn)定。而M-MCC處理過的L.monocytogenes、S.aureus胞外電導率上升，這說明M-MCC可能改變了細胞膜的通透性，或是破壞了細菌細胞膜，從而導致細菌胞內(nèi)離子和聚合物轉(zhuǎn)移到懸液中，造成電導率的變化。
圖9 M-MCC處理對L.monocytogenes和S.aureus胞外電導率的影響
2.6 M-MCC對細胞內(nèi)容物的影響
核酸和蛋白質(zhì)是生物細胞的重要組成部分，一般情況下，核酸和蛋白質(zhì)等大分子不會跨過活細胞的細胞膜運輸，因此，核酸和蛋白的泄漏情況可以一定程度上反映出細菌細胞膜的完整性。如圖10所示，經(jīng)過1 MIC和2 MIC處理后L.monocytogenes和S.aureus的OD260 nm和OD280 nm均有一定程度的上升，這說明部分L.monocytogenes和S.aureus細胞的核酸和蛋白質(zhì)泄漏到上清液中，即M-MCC對細菌細胞膜的完整性產(chǎn)生了影響，使菌體細胞死亡，導致核酸和蛋白質(zhì)泄漏。各處理組均在反應3 h左右核酸和蛋白的吸光度達到峰值，之后核酸和蛋白吸光度無明顯變化，即細菌的胞內(nèi)核酸和蛋白不再泄漏。所用M-MCC的濃度越高，上清液中核酸和蛋白質(zhì)檢出量越多，即對細菌細胞的破壞越嚴重。
圖10 M-MCC處理對L.monocytogenes（A）和S.aureus（B）細胞內(nèi)容物泄漏情況的影響
2.7 M-MCC對細胞DNA含量的影響
DAPI是一種能夠和DNA具有極強結(jié)合能力的熒光染料，能夠透過完整的細胞膜，因此一般用于活細胞的染色。利用DAPI的過膜能力，使之與L.monocytogenes活細胞的DNA相結(jié)合，觀察M-MCC對L.monocytogenes細胞DNA的影響。如圖11所示，對照組無處理的L.monocytogenes細胞熒光強度較強，而經(jīng)過1 MIC和2 MIC處理的細胞熒光強度明顯降低。這說明經(jīng)過M-MCC處理的細胞DNA發(fā)生了泄漏，細胞內(nèi)DNA含量降低，這也與核酸泄漏情況相符合。
圖11 M-MCC處理后的L.monocytogenes激光共聚焦圖像
3結(jié)論
本研究成功制備了具有抑菌效果的M-MCC抑菌劑，用以應對食品中L.monocytogenes和S.aureus的污染。通過SEM、EDS、FTIR、XPS、XRD和TGA表征改性后M-MCC的形貌變化、元素變化以及穩(wěn)定性，結(jié)果表明L-Met成功接枝。對M-MCC的體外抗氧化能力進行研究，發(fā)現(xiàn)其對ABTS陽離子自由基有著良好的去除效果。而后通過MIC以及細菌生長曲線進行了M-MCC對L.monocytogenes和S.aureus抑菌效果的研究。確定了M-MCC對L.monocytogenes和S.aureus的MIC為15 mg/mL。細菌生長曲線表明M-MCC能推遲指示菌的對數(shù)生長期。這可能與革蘭氏陽性菌獨特的細胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。通過研究細胞膜通透性、細胞膜完整性、細胞內(nèi)容物以及DNA含量等多個方面，分析了M-MCC對L.monocytogenes和S.aureus細胞膜的作用。相關(guān)結(jié)果表明，M-MCC處理對L.monocytogenes的生長有顯著的抑制效果，相應的胞外電導率、核酸和蛋白質(zhì)的含量都發(fā)生明顯的變化，且與處理時間的長短密切相關(guān)。綜上，M-MCC可能是直接作用于L.monocytogenes的細胞膜表面，較低濃度的M-MCC可增加細菌細胞膜的通透性，破壞細菌胞內(nèi)外電解質(zhì)平衡，從而抑制細菌的生長；較高濃度的M-MCC則劇烈作用于細菌細胞膜表面，破壞細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞死亡并釋放出原本胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等大分子，從而起到抑菌的作用。表明M-MCC抗菌劑在抗菌應用方面潛力巨大。
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