白馬耳組織成纖維細胞體外培養(yǎng)、冷凍前及復(fù)蘇后存活率、生長曲線繪制（三）
2.3烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞凍存前及復(fù)蘇后存活率對比
凍存前后在顯微鏡下計數(shù)，死細胞呈藍色，活細胞呈透明(圖4)，由于視野有限，僅挑選具有代表性的圖片于文章中，并非全部圖片。烏珠穆沁白馬耳組織不同代次成纖維細胞在冷凍保存前細胞存活率差別很小，存活率均達到98%以上，沒有顯著性差異;隨著細胞冷凍保存時間的延長，細胞的存活率逐漸下降，復(fù)蘇后細胞的存活率明顯低于凍存前，存活率在80%左右。但雌性烏珠穆沁白馬耳組織P9細胞復(fù)蘇后的存活率仍能達到90%以上(圖5)。
每組重復(fù)3次;、代表差異顯著(P<0.01、P<0.05)。
2.4烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的不同代次生長曲線對比
烏珠穆沁白馬細胞倍增時間隨著培養(yǎng)代次的增加而增加，而倍增次數(shù)則隨培養(yǎng)代次的增加而減少(表1)，說明隨著培養(yǎng)代次的增加，細胞增殖速度下降，活力降低。雄性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞培養(yǎng)過程中細胞生長曲線呈典型的“S”型(圖6a)，低代次細胞增殖速度較培養(yǎng)高代次細胞快，在培養(yǎng)6d或7d時細胞增殖數(shù)目達到最大值。雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞在P3~P6時細胞生長曲線呈典型的“S”型(圖6 b)，生長速度最快，P9時細胞生長曲線走勢平緩，生長活力沒有明顯的變化。
2.5烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞不同代次及不同時間的貼壁率對比
烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的貼壁率隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，6 h和12 h貼壁率均在較低的水平，24 h后貼壁率快速上升，大部分保持在90%左右(圖7)。
2.6烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體核型
使用顯微鏡以及遺傳工作站拍照測量及排列雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體，并統(tǒng)計成纖維細胞核型，從而判斷成纖維細胞遺傳的穩(wěn)定性。體外培養(yǎng)的雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體條數(shù)均為2n=64，其中，31對常染色體，1對性染色體(圖8)。本實驗選取的雄性、雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞在體外培養(yǎng)時生長狀態(tài)良好且維持了細胞的遺傳信息穩(wěn)定性。
3討論
本研究成功建立了雄性和雌性烏珠穆沁白馬的耳組織成纖維細胞系，并進行了相關(guān)的生物學特性分析，以檢測細胞系的生長狀況、細胞活力及其遺傳穩(wěn)定性，包括細胞貼壁率的測定、細胞生長曲線的繪制、細胞冷凍前及復(fù)蘇后存活率的測定、細胞染色體核型的分析、細胞系支原體污染的檢測，為后續(xù)實驗提供可靠的數(shù)據(jù)資料及穩(wěn)定的實驗材料。
細胞培養(yǎng)過程中，雌性和雄性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的形態(tài)及生長狀態(tài)略有差別，低代次時，雌性耳組織成纖維細胞生長形態(tài)及時間等各方面優(yōu)于雄性耳組織成纖維細胞，細胞貼壁率整體呈現(xiàn)貼壁時間長，短時間內(nèi)貼壁率與其他物種細胞相比較低。研究顯示，狍狍(Capreolus gray)(郭曉楠2021)以及馴鹿(Rangifer tarandus)(王丹妮2021)的耳組織細胞在6~12h內(nèi)迅速貼壁，而本實驗中烏珠穆沁白馬耳組織細胞的貼壁時間較長，可能是與細胞本身分泌細胞外基質(zhì)的能力以及細胞本身表達的黏附分子數(shù)量有關(guān)，但培養(yǎng)24h后烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的貼壁率與其他物種無顯著差異。雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞低代次貼壁所需時間較長，隨著代次的增加，貼壁所需時間減少，說明細胞生長趨于穩(wěn)定且狀態(tài)良好；雄性耳組織成纖維細胞隨著細胞培養(yǎng)代次的增加，細胞貼壁率穩(wěn)定所需時間也逐漸增加，在較低培養(yǎng)代次時細胞的貼壁率穩(wěn)定性最強。烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的生長曲線整體呈典型的"S"型，其中雌性成纖維細胞在P3時最大增殖細胞數(shù)量為46.38×10?個。對馴鹿耳組織成纖維細胞進行原代細胞建系培養(yǎng)并進行生物學特性分析，通過對生長曲線的測定發(fā)現(xiàn)，P45的最大增殖細胞數(shù)量為37.1×10?個(王丹妮2021)；對兔(Oryctolagus cuniculus)脾成纖維細胞進行原代建系培養(yǎng)并對其進行生物學特性分析，通過生長曲線測定發(fā)現(xiàn)該成纖維細胞在P67的最大增殖細胞數(shù)量為1.5×10?個(羅怡琳等2019)。烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞經(jīng)冷凍復(fù)蘇后細胞的存活率相對較好，與穆瑤等(2019)對中華鼢鼠(Eospalax fontanierii)成纖維細胞存活率的研究結(jié)果相近。郭曉楠(2021)對狍狍成纖維細胞復(fù)蘇后存活率的研究結(jié)果則略低于本研究，且不同代次狍狍成纖維細胞復(fù)蘇后細胞存活率存在顯著性差異，甚至于細胞復(fù)蘇后的存活率低至13%。根據(jù)比較分析可知，烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞的存活率較強，耐受冷凍性強，適合冷凍保存。
染色體核型的制備前期需要用秋水仙素對細胞進行處理，以獲得更多處于中期分裂相的細胞，而處理時間以及后續(xù)實驗中對細胞的低滲時間需要根據(jù)細胞的類型及生長狀況而定(于漾等2014，盧文亮等2021)，秋水仙素處理時間長短會直接影響染色體的形態(tài)，若處理時間太長，得到的染色體會呈現(xiàn)短粗型，低滲時間若太長會導致細胞破裂，制備得到的染色體大概率會出現(xiàn)丟失的情況(郭曉楠2021)。對阿巴嘎黑馬耳組織成纖維細胞的染色體核型研究得到其染色體條數(shù)為2n=64(王愛虹等2013)；對阿拉伯馬成纖維細胞的染色體核型研究得到染色體條數(shù)為2n=64(張靜南等2011)；采用外周血淋巴細胞短期培養(yǎng)方法，對蒙古馬染色體進行了核型分析，其二倍體細胞染色體數(shù)為2n=64(晁玉慶等1992)。本實驗中烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體條數(shù)為2n=64，且據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示雄性、雌性烏珠穆沁白馬耳組織細胞染色體中2n=64的比例占80%、85%，表明此研究培養(yǎng)得到的烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞可穩(wěn)定遺傳且具有良好的狀態(tài)。
通過組織貼壁培養(yǎng)得到的烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞，經(jīng)過多項生物學特性分析可知，細胞具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，純度高、增殖能力強，并且具有遺傳穩(wěn)定性，可對其進一步進行深入研究。
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