牛病毒性腹瀉病毒BVDV在MDBK細(xì)胞上一步生長(zhǎng)曲線
牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙ovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，主要以口腔、食管、胃、腸等部位黏膜侵蝕性或潰瘍性病變、腹瀉、白細(xì)胞減少、持續(xù)性感染及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒等癥狀為特征[1-2]。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)牛業(yè)國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。犢牛感染BVDV后，潛伏期7～9 d，發(fā)病率為2%～5%，犢牛死亡率可達(dá)90%。妊娠母牛在妊娠30～120 d間感染后可產(chǎn)持續(xù)性感染牛，持續(xù)性感染?？沙掷m(xù)排毒成為BVDV重要的傳染源，是飼養(yǎng)場(chǎng)無法根除BVDV的重要原因之一。通過檢測(cè)并淘汰持續(xù)性感染牛，是逐步實(shí)現(xiàn)BVDV凈化的重要手段。
牛病毒性腹瀉病毒感染是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病，開發(fā)檢測(cè)和診斷牛病毒性腹瀉的快速診斷技術(shù)對(duì)牛病毒性腹瀉的防控及凈化、推動(dòng)養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。為了預(yù)防與控制牛病毒性腹瀉病毒感染，科研人員建立了諸多分子生物學(xué)診斷方法。應(yīng)用地高辛、生物素等標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針，建立核酸雜交檢測(cè)方法，快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)BVDV[8]。白泉陽(yáng)等[10]、宋爽等針對(duì)BVDV保守的5’UTR設(shè)計(jì)引物和探針，建立Taqman熒光定量PCR方法，方便、快速地檢測(cè)BVDV，該方法敏感度高、重復(fù)性好。
表1 BVDV RT-qPCR重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果
圖4 BVDV在MDBK細(xì)胞上一步生長(zhǎng)曲線
熒光定量PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性高、敏感性高、重復(fù)性好、可實(shí)時(shí)定量等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括探針法和染料法，其中染料法相對(duì)探針法價(jià)格更低。目前熒光定量PCR已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)和診斷病原的重要手段[12]。對(duì)于非致細(xì)胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上不產(chǎn)生細(xì)胞病變，通過間接免疫熒光試驗(yàn)或間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)測(cè)定接毒后不同時(shí)間點(diǎn)收獲病毒的TCID50，進(jìn)而繪制非致細(xì)胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，此種測(cè)定方法耗力費(fèi)時(shí)。而應(yīng)用熒光定量PCR方法可快速定量地對(duì)病毒基因組進(jìn)行檢測(cè)，因此本試驗(yàn)將熒光定量PCR方法應(yīng)用于BVDV一步生長(zhǎng)曲線的繪制中。
為了實(shí)現(xiàn)測(cè)定BVDV NCP型一步生長(zhǎng)曲線，本試驗(yàn)根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5’UTR保守序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，建立了檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的SYBR Green熒光定量PCR方法并將該方法應(yīng)用于BVDV一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定中。研究中所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性和敏感性，但其存在不能特異性鑒別BVDV與豬瘟病毒的缺陷。這一缺陷，可根據(jù)瘟病毒屬成員5’UTR序列中的差異序列區(qū)設(shè)計(jì)特異性的探針，以改善熒光定量PCR方法的特異性。該方法的建立和應(yīng)用，為研究非致細(xì)胞病變型BVDV分離毒株的生長(zhǎng)特性的研究提供了一定的參考。
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