25種天然植物精油對藍(lán)莓致病菌生長曲線、抑制作用（三）
2結(jié)果與分析
2.1病原菌菌落形態(tài)學(xué)觀察與鑒定
經(jīng)過純化后的藍(lán)莓病原菌離體以及活體形態(tài)如圖1所示，共分離出4種形態(tài)的病原菌，分別命名為I、II、III、IV。病原菌I菌絲為白色，分生孢子梗為典型的掃帚狀，且彼此緊貼。孢子為暗綠色，呈圓形或橢圓形，直徑為3μm左右，分生孢子成熟后極易脫落。在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量高，正面質(zhì)地為絨毛狀，有時生長狀態(tài)呈放射狀，顏色為青綠色或者深綠色，背面產(chǎn)黃褐色色素。侵染藍(lán)莓后白色菌絲在傷口軟腐處蔓延并伴隨大量青色孢子產(chǎn)生，根據(jù)其形態(tài)特征與青霉屬特征相似度極高，推測病原菌I為青霉屬真菌。
圖1病原菌離體以及活體形態(tài)
病原菌II菌絲為白色，壁厚且光滑，頂部形成球形頂囊，頂囊上覆蓋一層?；托」?，分生孢子由小梗上產(chǎn)出。分生孢子為黑褐色，呈圓形或近圓形，直徑為4μm左右。在PDA培養(yǎng)基上最先蔓延的是一層微乳白的分泌物，產(chǎn)孢量高，正面質(zhì)地為絨狀，顏色為黑褐色或者棕褐色，背面白色或微黃。侵染藍(lán)莓后藍(lán)莓果肉軟腐，有黑色霉層覆蓋并伴隨汁液流出，根據(jù)其形態(tài)特征與曲霉屬中的黑曲霉相似，推測病原菌II為曲霉屬真菌。
病原菌III菌絲為褐色，有隔膜。分生孢子為棕褐色梭形或倒棒形，具有橫隔或者縱膈，形成壁磚狀結(jié)構(gòu)。在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量低，正面為褐綠色或深綠色絮狀，背面為褐色或黑褐色。侵染藍(lán)莓后傷口處有灰綠色霉層覆蓋，偶爾伴隨無色汁水流出，根據(jù)其形態(tài)特征與鏈格孢屬相似度高，推測病原菌III為鏈格孢屬真菌。
病原菌IV菌絲為白色，呈絮狀或者叢卷毛狀，纖細(xì)且密集。分生孢子為淺粉色，呈棒形。在PDA培養(yǎng)基上正面最先蔓延的是膜狀物，膜上附著著菌絲，部分中期正面為粉色，背面為橘紅色，后期正面會變成淺紫色，背面為深紫色。侵染藍(lán)莓后傷口處附著白色絮狀菌絲并伴隨粉色孢子產(chǎn)生。
2.2病原菌的致病力分析
將純化過的菌株制備菌懸液并回接至藍(lán)莓果實上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。如圖2所示，病原菌I侵染的藍(lán)莓果實在第2天傷口及周圍發(fā)生軟腐，偶有凹陷，能明顯觀察到菌絲蔓延，果實出現(xiàn)青綠色霉層，發(fā)病猛烈，在侵染第2天時發(fā)病率就達(dá)到了100%。病原菌II侵染的藍(lán)莓果實在第2天整果內(nèi)部逐漸軟腐，伴隨紅色汁水流出以及菌絲蔓延，果實傷口出現(xiàn)黑褐色霉層，發(fā)病猛烈，在侵染第3天時發(fā)病率達(dá)到100%。病原菌III侵染的藍(lán)莓果實在第3天傷口周圍開始出現(xiàn)凹陷，伴隨無色汁水流出，菌絲蔓延速度稍慢，果實傷口出現(xiàn)灰綠色霉層，在侵染第3天發(fā)病率達(dá)到100%。病原菌IV侵染的藍(lán)莓果實，菌絲大多數(shù)在傷口處生長，病斑為白色絮狀，傷口不發(fā)生明顯擴張，雖然在侵染第3天時發(fā)病率也達(dá)到了100%，但致病癥狀較前3種菌輕。綜合致病力實驗結(jié)果，4種致病菌的致病力排序為病原菌I＞病原菌II＞病原菌III＞病原菌IV。
圖2 4種病原菌侵染藍(lán)莓果實的癥狀（A）和發(fā)病率（B）
2.3系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
利用ITS、BenA和CaM基因進一步對4種致病菌進行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果如圖3所示。病原菌I、II分別與皮落青霉（Penicillium crustosum）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）進化關(guān)系最近，病原菌III的ITS與鏈格孢菌（Alternaria alternata）的ITS序列同源性最高，生長狀態(tài)也符合形態(tài)學(xué)上對鏈格孢菌的描述，病原菌IV的BenA序列與串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）的BenA序列同源性最高。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，確定分離出來的病原菌I為皮落青霉，病原菌II為塔賓曲霉，病原菌III為鏈格孢菌，病原菌IV為串珠鐮刀菌?？紤]到病原菌IV的致病力較弱，因此后續(xù)部分實驗只針對藍(lán)莓優(yōu)勢致病病原菌I、II和III展開。
圖3 4種藍(lán)莓致病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.4病原菌生長條件分析
2.4.1最適生長溫度
如圖4所示，在4℃條件培養(yǎng)時病原菌II完全不長，病原菌I和III仍能保持緩慢生長。隨著培養(yǎng)溫度的升高，3種菌的生長速度均增加，其中病原菌I和III的生長速度在25℃時達(dá)到最高，溫度繼續(xù)增加則生長速度降低，且溫度越高抑制效果越明顯，最適溫度在25℃左右。在4～28℃范圍，病原菌II的生長速度隨培養(yǎng)溫度升高持續(xù)增加，之后溫度再增加，病原菌仍保持較快的生長速度，表現(xiàn)出較好的溫度耐受性，最適生長溫度在28℃左右。
圖4 3種病原菌在不同溫度條件下的生長情況
2.4.2生長曲線
采用非線性擬合的方法能夠更清晰地了解到病原菌I、II和III的生長情況，結(jié)果如圖5所示。6～48 h和48～72 h分別是病原菌I的生長對數(shù)期和生長穩(wěn)定期；12～36 h和36～72 h分別是病原菌II的生長對數(shù)期和生長穩(wěn)定期；0～36、36～66 h和66～72 h分別是病原菌III的生長調(diào)整期、生長對數(shù)期和生長穩(wěn)定期。
圖5病原菌I（A）、病原菌II（B）和病原菌III（C）的生長曲線
2.4.3孢子萌發(fā)率
如圖6所示，3種病原菌在培養(yǎng)6 h時均已萌發(fā)，其中病原菌I的孢子萌發(fā)率最高（33%），病原菌II次之（19.67%），病原菌III最低（15.59%）。隨著培養(yǎng)時間的延長，3種病原菌的孢子萌發(fā)率持續(xù)增加，且均在12 h完全萌發(fā)。
圖6 3種病原菌的孢子萌發(fā)率
2.5植物精油體外抑菌效果分析
2.5.1 25種植物精油的作用效果
由于驗證的植物精油種類較多，以致病力最強的病原菌I（皮落青霉）為研究對象，篩選作用效果較好的植物精油。如表1所示，在25種植物精油中，濃度為2μL/mL的芥末精油、牡荊精油、花椒精油、茉莉精油、依蘭精油、細(xì)辛精油、艾草精油、續(xù)斷精油、丁香羅勒精油、紅景天精油能完全抑制病原菌I的生長，山蒼子精油對病原菌I的抑菌濃度為1.5μL/mL，艾草精油和快樂鼠尾草精油對病原菌I的抑菌濃度為2μL/mL，其他精油對病原菌I的抑菌濃度均高于2μL/mL。
表1 25種植物精油體外對皮落青霉生長的影響
注：25種精油均為精油＋吐溫＋PDB＋皮落青霉；＋.有菌絲生長；-.無菌絲生長。下同。
選取抑菌濃度小于2μL/mL的植物精油對病原菌II（塔賓曲霉）進行作用效果檢測，發(fā)現(xiàn)芥末精油、丁香羅勒精油對病原菌II的抑菌濃度均為1μL/mL，茉莉精油、續(xù)斷精油、山蒼子精油、紅景天精油對病原菌II的抑菌濃度均為2μL/mL（表2）。
表2 12種植物精油體外對塔賓曲霉生長的影響
2.5.2精油的有效抑菌濃度分析
根據(jù)96孔板初篩出的精油種類、作用濃度（≤2μL/mL）以及剔除不易被人接受的芥末精油，最終篩選出茉莉精油、丁香羅勒精油、續(xù)斷精油、山蒼子精油和紅景天精油5種精油進行平板驗證實驗。如圖7所示，2μL/mL的茉莉精油、丁香精油、山蒼子精油和紅景天精油能完全抑制病原菌I、II、III和IV的生長，2μL/mL的續(xù)斷精油可完全抑制病原菌I、II和III的生長，對IV的抑菌率為97%。這5種精油對4種病原菌均具有高效的體外抑菌效果。
圖7 5種植物精油對4種病原菌生長的影響
進一步測定了5種植物精油對4種病原菌的MIC和MFC，結(jié)果如表3所示。5種精油對病原菌I的MIC以及MFC為丁香羅勒精油＝山蒼子精油＜茉莉精油＝續(xù)斷精油＝紅景天精油；對病原菌II的MIC以及MFC為山蒼子精油＜丁香羅勒精油＜茉莉精油＝續(xù)斷精油＝紅景天精油；對病原菌III的MIC以及MFC為山蒼子精油＜丁香羅勒精油＜茉莉精油＝紅景天精油＜續(xù)斷精油；對病原菌IV的MIC以及MFC為山蒼子精油＜茉莉精油＝丁香羅勒精油＜紅景天精油＜續(xù)斷精油。5種精油對4種菌的MIC范圍在0.5～2μL/mL，MFC范圍在1～4μL/mL，且每種精油對每種菌的MFC/MIC均不超過2倍。山蒼子精油和丁香羅勒精油對病原菌I、II、III皆表現(xiàn)出較好的抑菌效果，MIC均不超過1μL/mL，MFC均不超過2μL/mL。
表3 5種植物精油對4種致病菌的MIC和MFC
2.6 5種植物精油對接種皮落青霉的藍(lán)莓果實病害發(fā)生的影響
如圖8所示，對照組藍(lán)莓果實在接種皮落青霉的第2天，傷口出現(xiàn)明顯病斑和霉層，隨著貯藏時間的延長，病斑逐漸擴大。在第6天時，果實發(fā)病率為100%，病斑布滿藍(lán)莓果實，果實發(fā)生嚴(yán)重腐爛。相比對照組，茉莉精油和山蒼子精油處理組的藍(lán)莓果實青霉病在貯藏期間得到了較好的控制，在貯藏結(jié)束時果實發(fā)病情況和表面的霉層仍然較少。在貯藏第6天，茉莉精油、丁香羅勒精油、續(xù)斷精油、山蒼子精油和紅景天精油處理組的發(fā)病率分別為72.5%、100%、97.5%、15%和97.5%，丁香羅勒精油、續(xù)斷精油和紅景天精油在藍(lán)莓果實上沒有表現(xiàn)出明顯的病害控制效果。山蒼子精油和茉莉精油熏蒸對藍(lán)莓青霉病發(fā)生有較好的控制作用，其中山蒼子精油的作用效果最佳，茉莉精油次之。
圖8 5種植物精油對接種皮落青霉的藍(lán)莓果實病害發(fā)生的影響
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